人胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)酶聯(lián)免疫分析

1、人胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用產(chǎn)品編號：E1320h預(yù)期應(yīng)用ELISA法定量測定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)含量。實(shí)驗(yàn)原理本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中TSLP水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入TSLP、生物素化的抗人TSLP抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TSLP呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計(jì)算

2、樣品濃度。 試劑盒組成及試劑配制 1. 酶聯(lián)板：一塊（96孔） 2. 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為20 ng/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成10 ng/mL，5 ng/mL，2.5 ng/mL，1.25 ng/mL，0.625 ng/mL，0.312 ng/mL，0.156 ng/mL，其原液直接作為最高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制20 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 10 ng/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中

3、，混勻即可，其余濃度以此類推。3. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。4. 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。5. 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。6. 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。7. 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。8. 底物溶液：1

4、5;10ml/瓶。 9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 標(biāo)本的采集及保存 1細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。2血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時(shí)或4過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。3血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注：標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此

5、項(xiàng)檢測。操作步驟實(shí)驗(yàn)開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00ul，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混

6、勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37,60分鐘。3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。 4. 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul，37，60分鐘。5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。6. 依序每孔加底物溶液90ul，37避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。7. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)

7、時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。注：1 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。測量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。 2為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。3. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8保存。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。4. 建議檢測樣品時(shí)均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁

8、）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。特異性 本試劑盒可同時(shí)檢測天然的人TSLP，且與其它相關(guān)無交叉反應(yīng)。計(jì)算 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。 注意事項(xiàng)1 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。2 一次加樣時(shí)間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。3 請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。4 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計(jì)算時(shí)請最后乘以稀釋倍數(shù)。5在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時(shí)，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。6底物請避光保存。檢測范圍：0.156 ng/mL -10 ng/mL說明 1