側(cè)柏葉醇提取物抗炎作用的研究

1、中 國 藥 科 大 學(xué) 學(xué) 報(bào)Journal of China Pharmaceutical University 2001, 32(3 :224226側(cè)柏葉醇提取物抗炎作用的研究梁 統(tǒng) 3, 覃燕梅 1, 梁念慈 1(廣東天然藥物研究開發(fā)實(shí)驗(yàn)室 , 1廣東醫(yī)學(xué)院生化教研室 , 湛江 524023摘 要 目的 :探討側(cè)柏葉醇提取物的抗炎機(jī)理 。 方法 :以大鼠胸腔白細(xì)胞及兔血小板為材料 , 用高效液相 色譜法測定細(xì)胞白三烯 、 122羥十七碳三烯酸及 122羥廿碳四烯酸的生成 。 結(jié)果 :側(cè)柏葉醇提取物對白細(xì)胞內(nèi)白 三烯 B 4及 52羥廿碳四烯酸的生物合成有較強(qiáng)的抑制作用 , 其 IC 50

2、值分別為含生藥 0. 4mg/ml 及生藥 0. 41mg/ml 。 側(cè)柏葉醇提取物還可顯著抑制血小板 122羥十七碳三烯酸的生物合成 。 結(jié)論 :側(cè)柏葉醇提取物中含有較強(qiáng)的抗 炎成分 , 其作用機(jī)制與抑制花生四烯酸的代謝有關(guān) 。關(guān)鍵詞 側(cè)柏葉 ; 白三烯 B 4; 122羥十七碳三烯酸中圖分類號(hào) :R972+. 4;R94414 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 :A 文章編號(hào) :1000(2001 20224 側(cè)柏葉 (Biota orientalis 為傳統(tǒng)中藥 ,止血 、 清肺止咳 、 抑菌等功能 1(PAF 拮抗 PAF Pinus olide 2,3; 側(cè)柏葉乙酸乙酯 提取物具有松馳氣管平滑肌的作用 4

3、。我們在篩 選抗炎藥物的過程中 , 發(fā)現(xiàn)側(cè)柏葉醇提取物具有較 強(qiáng)的抗炎活性 , 為進(jìn)一步探討其抗炎機(jī)制 , 本研究 從花生四烯酸代謝的三個(gè)主要途徑 52脂氧合酶 、 環(huán) 加氧酶及 122脂氧合酶代謝途徑探討其醇提取物對 白三烯 B 4(LT B 4 、 52羥廿碳四烯酸 (52HETE 、 122羥 十七碳三烯酸 (122HHT 和 122羥廿碳四烯酸 (122 HETE 生物合成的影響 。1 儀器與試藥1. 1 試劑花生四烯酸 、 LT B 4、 52HETE 、 122HHT 、 鈣離子載 體 A23187、 角叉菜膠 、 槲皮素 、 5,8,11,142eicosate 2 trayno

4、ic acid (ETY A 為 Sigma 公司產(chǎn)品 , 乙腈 、 甲醇 (色譜純 , 其余為分析純試劑 。 側(cè)柏葉購自湛江藥 材公司 , 經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室茍占平碩士鑒定為 Platychadus orientalis (L. Franco. 。 用 95%乙醇回流提取 、 濃縮 成浸膏 , 含生藥為 10. 5g/g 。Wistar 大鼠 ,3kg 大白兔 , 均由 。1. 3 儀器采用島津公司的 LC 210ADVP 液相色譜系統(tǒng) , 分析柱為 S pheris orb C 18,250×4. 6mm ,5m (大連依 利特公司 。2 方 法211 細(xì)胞制備2. 1. 1 測定 52

5、脂氧合酶細(xì)胞懸浮液的制備 5 乙 醚麻醉正常雄性大鼠 , 于右胸腔注射 1%角叉菜膠 0. 2ml ,5h 后將大鼠斷頭處死 , 吸出胸腔滲出液 , 加入 2ml P BS 溶液中 (內(nèi)含肝素 12. 5u/ml , 加 2 ml P BS 溶液沖洗胸腔 , 與滲出液合并 ,2000r/min 離心 10min , 沉淀細(xì)胞加入 2ml 冷凍蒸餾水溶解紅 細(xì)胞 ,1min 后立即加入 1. 8%NaCl (內(nèi)含肝素 12. 5 u/ml 2ml , 2000r/min 離心 5min , 沉淀用 P BS 溶液 懸浮配成白細(xì)胞懸浮液 (1×107細(xì)胞 /ml 。含中性 粒細(xì)胞約 85

6、%。2. 1. 2 分析環(huán)加氧酶及 122脂氧合酶兔血小板的 制備 抽兔心臟血用 100mm ol/L E DT A 按 14 1抗 凝 ,1000r/min 離心 8min , 吸取富含血小板血漿422收稿日期 2001201202 3通訊作者 T el :075922388405 E 2mail :liangtgdmc. cn 基金項(xiàng)目 :廣東省衛(wèi)生廳基金資助項(xiàng)目 (2000486(Platelet 2rich Plasma , PRP 3000r/min 離心 10min , 用含 1mg/ml E DT A P BS 溶液沖洗血小板 ,2500r/ min 離心 10min , 血小板

7、懸浮于 P BS 溶液中 , 調(diào)血小 板濃度為 2. 5×108細(xì)胞 /ml 。2. 2 溫孵及產(chǎn)物的提取2. 2. 1 52脂氧合酶溫孵及產(chǎn)物的提取 參照文獻(xiàn) 6, 取白細(xì)胞懸液 1ml , 加藥或溶劑 (二甲亞砜濃 度少于 0. 5% , 每個(gè)藥物濃度做 3次 , 以槲皮素 (quercetin 作陽性對照 。于 37 溫孵 10min , 加入 下列物質(zhì) , 并使終濃度分別為 :Ca 2+2. 0mm ol/L , Mg 2+0. 5mm ol/L , 花生四烯酸 40m ol/L , 鈣離子載 體 A231873m ol/L , 繼續(xù)溫孵 5min , 立即加入 5ml 乙酸

8、乙酯 (內(nèi)含 20l 冰醋酸 終止反應(yīng)及 200ng 安 定作內(nèi)標(biāo) , 旋渦振蕩 2min , 轉(zhuǎn)移上層乙酸乙酯 4. 5 ml , 氮?dú)獯蹈?, 殘?jiān)?30l 甲醇溶解 ,5l 進(jìn)樣用 反相高效液相色譜分析 。2. 2. 2 環(huán)加氧酶及 122提取 4 1, 52酶測定 , 。2. 32. 3. 1 52脂氧合酶產(chǎn)物 LT B 4及 52HETE 的測定 流動(dòng)相 A , 甲醇 2水 2乙酸 (30 70 0. 05,pH 310 , 流 動(dòng)相 B :乙腈 2甲醇 2水 2乙酸 (60 20 20 0. 05,pH 3. 0 ; 梯度洗脫 , 從含流動(dòng)相 B 65%開始 ,15min B 增

9、 加到 100%, 分析過程 20min , 流速 1. 0ml/min ; 用 雙波 長 同 時(shí) 檢 測 , 275nm 測 LT B 4, 235nm 測 52 HETE , 其峰高與內(nèi)標(biāo)安定 (兩個(gè)波長都有吸收 之 比值表示相對含量 。2. 3. 2 環(huán)加氧酶產(chǎn)物 122HHT 及 122脂氧合酶產(chǎn)物 122HETE 的測定 采用 235nm 波長測 122HHT 及 122HETE , 其余條件同 52脂氧合酶產(chǎn)物測定 。3 結(jié) 果3. 1 側(cè)柏葉醇提取物對白細(xì)胞 LT B 4及 52HETE 生 物合成的影響用不同濃度的側(cè)柏葉醇提取物與白細(xì)胞懸液 一起溫孵 , 在生藥濃度 0. 20

10、. 8mg/ml 的范圍內(nèi) , 側(cè) 柏葉對外源性花生四烯酸轉(zhuǎn)變成 52HETE 及 LT B 4的抑制作用呈量效關(guān)系 , 其 IC 50分別為含生藥 0. 41,0. 40mg/ml ; 用槲皮素作陽性對照 ,0. 85g/ml (2. 5nm ol/ml 的濃度對 52HETE 及 LT B 4的抑制率 分另為 47. 6%及 46. 4%, 結(jié)果見表 1。T ab 1. E ffect of the extract from Biota orientalis on 52HETE and LT B 4for 2 mation ( x ±s , n =3Drugcmg ml -1In

11、hibitory rate (% IC 50(c /mg ml -1 52HETE LT B 452HETE LT B 4 C ontrol 0-E BO 0. 2013. 3±0. 415. 2±0. 70. 410. 40 0. 4045. 8±2. 747. 4±1. 40. 6068. 1±2. 667. 5±2. 70. 8090. 8±3. 792. 2±2. 1Quercetin a 0. 8547. 6±3. 146. 4±2. 61. 7086. 2±2. 989.

12、3±3. 9 E BO :Extract of Biota orientalis ; a c /g ml -13. 2側(cè)柏葉醇提取物對血小板 122HHT 及 122 HETE 合成的抑制作用2, 分別 , 于血小 , , 122HHT 合成 作用 ,IC 50為 0. 54mg/ml 生藥 , 而 1mg/ml 的濃度未 顯示對 122HETE 合成的抑制作用 。以環(huán)加氧酶 、 122脂氧合酶雙通道抑制劑 ETY A 作陽性對照 ,10m ol/L (2. 9g/ml 的 ETY A 對血小板 122HHT 及 122HETE 的合成的抑制率分別為 88. 0%及 9414%, 見

13、表 2。T ab 2. E ffect of the extract from Biota orientalis on 122HHT and 122HETE formation ( x ±s , n =3Drugcmg ml -1Inhibitory rate (% IC 50(c /mg ml -1 122HHT 122HETE 122HHT control 0-E BO 0. 2518. 5±1. 3-2. 4±0. 630. 540. 5043. 2±1. 70. 5±0. 231. 0072. 9±2. 62. 8±

14、1. 13a 2. 9088. 0±3. 194. 4±4. 1 a c /g ml -1 3P <0. 05(vs ,control 4 討 論LT B 4和 52HETE 是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物 , 前 者是白細(xì)胞的強(qiáng)趨化劑和激活劑 , 后者為白細(xì)胞的 激活劑 , 在炎癥過程中起重要作用 。 LT B 4和 52 HETE 在白細(xì)胞中的生物合成主要涉及磷脂酶 A 2和 52脂氧合酶的活性 , 若加入過量外源性花生四烯 酸 , 則生成 LT B 4及 52HETE 的量主要反映 52脂氧合 酶的活性 5。本研究結(jié)果顯示 , 側(cè)柏葉對白細(xì)胞 5223期 梁 統(tǒng)等 :

15、側(cè)柏葉醇提取物抗炎作用的研究LT B 4及 52HETE 的生物合成有較強(qiáng)的抑制作用 , 提 示側(cè)柏葉是通過抑制 52脂氧合酶的活性發(fā)揮作用 。 在血小板中花生四烯酸可經(jīng)環(huán)加氧酶途徑生成 122 HHT 及經(jīng) 122脂氧合酶途徑轉(zhuǎn)變?yōu)?122HETE , 122 HHT 是白細(xì)胞趨化劑 , 可作為反映環(huán)加氧酶活性 的指標(biāo) 7210, 側(cè)柏葉亦顯示了對環(huán)加氧酶較強(qiáng)的抑 制作用 , 提示側(cè)柏葉中含有較強(qiáng)的抑制 52脂氧合酶 及環(huán)氧化酶的成分 , 表明了側(cè)柏葉具有進(jìn)一步開發(fā) 研究的前景 。參 考 文 獻(xiàn)1 李世全 (Li S Q . 秦嶺巴山天然藥物志 M.西安 :陜西科學(xué)技 術(shù)出版社 ,1987.

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17、 B . 側(cè)柏 J.中草藥(Chin Tradit Pat Med ,1999, 30(4 :278227915 王文杰 (W ang W J , 白金葉 (Bai J Y , 劉大培 (Liu DP 等 . 紫草 素抗炎作用及對白三烯 B4生物合成的抑制作用 J.藥學(xué)學(xué) 報(bào) (Acta Pharm Sin ,1994, 29(3 :161216316 Hatzelmann A ,Ullrich V. Regulatiom of 52lipoxygenase activity by the glutathione status in human polym orphonuclear leuko

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21、Laboratory for Research and Development o f Natural Drugs , Guangdong Medical College , Zhanjiang 524023; 1Department o f Biochemistry , Guangdong Medical CollegeAbstract AIM The purpose is to investigate the Anti 2in flammatory mechanism of Biota orientalis . METH ODS Using rat leukocytes and rabbit platelets as experimental material the biosynthesis of leukotriene , 122hydroxyheptade 2 catrienoic acid (122HHT and 122hydroxyei