健腦膠囊防治潑尼松性大鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷的作用研究

1、健腦膠囊防治潑尼松性大鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷的作用研究                作者：鄒麗宜， 吳鐵， 崔燎， 許碧蓮， 張新樂【關(guān)鍵詞】  潑尼松；,糖皮質(zhì)激素；,神經(jīng)系統(tǒng)；,健腦膠囊；,大鼠摘要：目的探討長(zhǎng)期大量應(yīng)用潑尼松對(duì)大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用，同時(shí)觀察中藥復(fù)方健腦膠囊對(duì)潑尼松性神經(jīng)系統(tǒng)損害的防治作用。方法4月齡SD雄性大鼠50只隨機(jī)分成5組，除正常組外其余4組予潑尼松2.7 mgkg1灌胃，1次/d，連續(xù)12周。健腦膠囊治療組

2、同時(shí)予健腦膠囊3種劑量提取液 (2.5， 5.0， 10.0 gkg-1d-1)予治療。實(shí)驗(yàn)中測(cè)試大鼠的應(yīng)激記憶力，測(cè)定腦勻漿中MAO，SOD，AchE、MDA的含量以及對(duì)大腦進(jìn)行組織學(xué)檢查。結(jié)果單用潑尼松大鼠的三臂電迷宮正確率、腦勻漿中的SOD含量顯著下降而MAO含量上升（P<0.01）；腦神經(jīng)元發(fā)生水腫變性，皮質(zhì)厚度變薄，皮層和海馬結(jié)構(gòu)紊亂，而健腦膠囊可有效保護(hù)神經(jīng)元及升高SOD的含量及降低MAO的含量以及提高迷宮正確率（P<0.05）。結(jié)論 潑尼松長(zhǎng)期應(yīng)用可造成大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能減退，健腦膠囊對(duì)其有較好的對(duì)抗作用，但量效關(guān)系不明顯。關(guān)鍵詞：潑尼松；  糖皮質(zhì)激素；

3、  神經(jīng)系統(tǒng)；  健腦膠囊；  大鼠The Preventive Effects of Jiannao Capsule on Cerebra Damage Induced by Prednisone in RatsAbstract：ObjectiveTo study the cerebral damage induced by long-term administration of prednisone, and investigate the prevention effects of  Jiannao capsule on rats.  M

4、ethodsFifty fourmonth SD male rats were randomly divided into 5 groups with 10 rats per group. Group 1 was treated orally with vehicle as control (NS group), other groups were administered oraly with prednisone (2.7 mgkg-1d-1) first, and then with vehicle (PD group), or water extract of Jiannao caps

5、ule with three different doses (2.5, 5.0, 10.0gkg-1d-1), once a day for 12 weeks. Then the 10%  cerebrums inhomogenate was used to test the content of monoamine oxidase (MAO), superoxide dismutase (SOD) and acetylcholinesterase (AchE). The right half of cerebrums was used for testing the histol

6、ogical observation.ResultsBiochemical parameters of cerebrums plasm showed that the concentration of MAO increased,  SOD and AchE decreased significantly in PD group. Moreover, histopathology showed that the structure of cerebrum cortex became thinner and hippocampi was in disorder. Dropsical a

7、nd necrotic nerve cells were found. The water extract of Jiannao could prevent the changes of nerve centre in prednisone rats. ConclusionThe treatment of Jiannao Capsule can prevent the damage of nerve centre which caused by prednisone.Key words：Prednisone;   Glucocorticoid ;  Cerebra

8、 damage;  Jiannao capsule;  Rats     糖皮質(zhì)激素是有腎上腺皮質(zhì)分泌的一種具有神經(jīng)活性的甾體激素，其產(chǎn)生直接受到下丘腦垂體腎上腺軸的影響，可對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能有深刻的影響1。研究表明，超生理劑量的糖皮質(zhì)激長(zhǎng)期應(yīng)用不但損害外周的免疫系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等，還會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)尤其是對(duì)海馬神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用2，臨床上也觀察到某些患者在接受大劑量的糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期治療后出現(xiàn)記憶力下降、精神失常、甚至癡呆的現(xiàn)象。由于糖皮質(zhì)激素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用尚未明了，因此在本實(shí)驗(yàn)中研究了潑尼松長(zhǎng)期超生理量應(yīng)用對(duì)動(dòng)物智力和腦組織結(jié)構(gòu)的影響，

9、以探討糖皮質(zhì)激素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的可能作用原理以及研究中藥健腦膠囊對(duì)其的防治作用。1  材料與方法1.1  動(dòng)物   4月齡未交配的SpragueDawley（SD）雄性大鼠50只，SPF級(jí)，平均體重(228±10)g，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：2002A014）。飼養(yǎng)在(25±1)的恒溫及濕度為40%70%的空調(diào)環(huán)境中,隔日換墊料，專室飼養(yǎng)，專人負(fù)責(zé)；使用經(jīng)嚴(yán)格消毒后的標(biāo)準(zhǔn)飼料和純凈過濾水進(jìn)行喂養(yǎng)，所有動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有足夠的活動(dòng)空間，可自由攝食、攝水。1.2  藥物與試劑&#

10、160; 醋酸潑尼松：原料，浙江仙居制藥股份有限公司生產(chǎn)（批號(hào)981220）；健腦膠囊水提液高、中、低劑量：由廣東醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科技開發(fā)中心提供（030807）。單胺氧化酶測(cè)試盒（MAO）測(cè)定試劑盒、（MDA）丙二醛測(cè)定試劑盒、乙酰膽堿酯酶（TCHE）測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒、考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒均由南京建成生物工程公司提供。1.3  儀器 LEICA QWIN圖象分析儀（德國(guó)萊卡）；752紫外分光光度計(jì)(上海第三醫(yī)學(xué)儀器廠生產(chǎn))；電感偶合等離子體直讀光譜儀（日本島津）；梅特勒托利多AE240電子天平（梅特勒托利多儀器公司上海分公司）；MG2型迷宮刺激器（張家港市生

11、物醫(yī)學(xué)儀器廠）。動(dòng)物分組及處理：50只SD大鼠的體重按照Microsoft Excel 帶的宏程序Analys32.x11產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)列，并利用產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)列進(jìn)行分組，一共分為5組，每組10只，具體為（1）NS組：正常對(duì)照組，每天先予NS按5 mlkg1灌胃1次，1 h后重復(fù)。（2）PD組：潑尼松模型組，每天予潑尼松2.7 mgkg1灌胃，后灌予NS 5 mlkg1。（3）健腦膠囊高劑量組（JLH）：予潑尼松2.7 mgkg1d 1灌胃，后予健腦膠囊高劑量提取液（含淫羊藿，丹參，甘草等，每100 ml含生藥量100 g）按5 mlkg1灌胃給藥；（4）健腦膠囊中劑量組（JLM）：潑尼松2.7 m

12、gkg1d 1灌胃，后予健腦膠囊中劑量提取液（含淫羊藿，丹參，甘草等，每100 ml含生藥量50 g）按5 mlkg1灌胃給藥。（5）健腦膠囊低劑量組（JLL）：潑尼松2.7 mgkg1d 1灌胃，后予健腦膠囊低劑量提取液（含淫羊藿、丹參、甘草等，每100 ml含生藥量25 g）按5 mlkg1灌胃給藥。所有動(dòng)物按照隨機(jī)原則分組后觀察1 d，第2天開始灌胃給藥，qd，連續(xù)12周。1.4  觀察指標(biāo) 1.4.1   三臂迷宮正確率大鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1周用MG2型三臂迷宮刺激器檢測(cè)其對(duì)刺激的記憶反應(yīng)能力，實(shí)驗(yàn)前先測(cè)試大鼠在受到電刺激后首先逃避的方向，如逃向左側(cè)常見，則以

13、左側(cè)定為電擊區(qū)（如區(qū)），右側(cè)為安全區(qū)（如區(qū)）；實(shí)驗(yàn)正式開始時(shí)，臂為起步區(qū)，其中和帶電，而不帶電，第1天先訓(xùn)練動(dòng)物建立記憶痕跡，每只大鼠先跑20次，記錄其正確率，24 h后重復(fù)，但此次電擊前先延時(shí)5 s，同時(shí)給紅燈提示，觀察大鼠受激反應(yīng)情況，72 h后再重復(fù)，記錄實(shí)驗(yàn)中大鼠的正確次數(shù)和錯(cuò)誤次數(shù)，計(jì)算其正確率。1.4.2  腦指標(biāo)測(cè)定 在低溫條件下條件下迅速取左側(cè)大腦于20急凍，用于制成10%勻漿測(cè)定MAO、SOD、AchE、MDA的含量，并取右側(cè)大腦用Bouin液固定，常規(guī)石蠟包埋后切片，HE染色，腦切片用于觀察海馬和皮層的結(jié)構(gòu)變化。1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有測(cè)定指標(biāo)均采用均數(shù)

14、加減標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示（±s ），數(shù)據(jù)分析使用SPSS軟件中的方差分析（ANOVA）進(jìn)行檢驗(yàn)，先用Levene's test對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，如方差齊用Bonferroni檢驗(yàn)，如方差不齊則用Tamhane's T2 檢驗(yàn)，以P<0.05，P<0.01表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2  結(jié)果2.1  健腦膠囊對(duì)潑尼松大鼠三臂迷宮檢測(cè)正確率的影響 各組大鼠三臂迷宮正確次數(shù)（CT）、錯(cuò)誤次數(shù)（ET）和正確率（%CR）見表1。表1  健腦膠囊對(duì)潑尼松大鼠迷宮正確率的影響（略）與NS組比較，PD組大鼠活動(dòng)明顯減少，活動(dòng)減少，對(duì)外界刺激的反應(yīng)

15、能力顯著下降，由表1可以看出，迷宮測(cè)試實(shí)驗(yàn)中%CR顯著下降（P<0.01），提示長(zhǎng)期使用潑尼松可使大鼠發(fā)生記憶力衰退。健腦膠囊治療3組中，%CR雖然比NS組下降，但與PD組比, JLH組大鼠迷宮正確率卻顯著提高（P<0.01），JLM組和JLL組也明顯提高（P<0.05），且JLH組的%CR與NS組相比差異無顯著意義。提示健腦膠囊有效改善潑尼松所致的大鼠記憶能力衰退作用。 2.2  健腦膠囊對(duì)潑尼松大鼠腦勻漿生化指標(biāo)的影響各組大鼠大腦重量（CW）及腦勻漿中MAO（單胺氧化酶）、SOD（超氧化物歧化酶）、AchE（乙酰膽堿酯酶）、MDA（丙二醛）含量影響見表2。表2&

16、#160; 健腦膠囊對(duì)潑尼松大鼠腦勻漿生化指標(biāo)的影響（略）與NS組比較， 使用潑尼松后幾組大鼠的大腦重量有下降趨勢(shì)，但差異無顯著意義。在PD組中，腦勻漿中SOD和AchE含量明顯下降(P<0.01)，而MAO的含量顯著升高(P<0.01)，MDA含量無明顯變化不大(P>0.05)。與PD組比較，健腦膠囊治療3組可顯著升高SOD和AchE的含量而降低MAO的含量(P<0.01)，提示潑尼松長(zhǎng)期應(yīng)用可導(dǎo)致大鼠腦勻漿生化指標(biāo)的變化，健腦膠囊可在一定程度上對(duì)抗?jié)娔崴傻闹袠行圆涣挤磻?yīng)。2.3  健腦膠囊對(duì)潑尼松大鼠腦組織結(jié)構(gòu)影響各組大鼠海馬單位面積大錐體細(xì)胞數(shù)（HN）、

17、大腦皮層厚度（CW）及分子層厚度和皮層的總厚度的比值(M/C)的影響結(jié)果見表3。表3  健腦膠囊對(duì)潑尼松大鼠腦組織結(jié)構(gòu)影響（略）各組大鼠大腦外觀無顯著差異，未見明顯的腫脹、萎縮或顏色變化。光鏡下可見長(zhǎng)期應(yīng)用潑尼松后大鼠紋狀皮質(zhì)分子層厚度有增加趨勢(shì)而皮層總厚度(CW)有減少趨勢(shì)，細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞發(fā)生明顯水腫，可見有細(xì)胞發(fā)生明顯變性壞死，海馬區(qū)神經(jīng)元排列分散，胞體腫脹或皺縮，有較多的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生核固縮甚至溶解死亡。與NS組比，長(zhǎng)期應(yīng)用潑尼松后大鼠分子層厚度和皮層的總厚度比值(M/C)上升，海馬CA2區(qū)單位面積大錐體細(xì)胞數(shù)（HN）有下降趨勢(shì)，提示長(zhǎng)期超生理劑量使用潑尼松可造成大鼠海馬

18、皮層萎縮，神經(jīng)元細(xì)胞腫脹壞死。與PD組相比，健腦膠囊治療組的大鼠皮層厚度增加，單位面積里神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增加，變性壞死的程度也減少，提示健腦膠囊對(duì)潑尼松造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷有一定的預(yù)防作用。3  討論下丘腦垂體腎上腺皮質(zhì)軸（HPA）是機(jī)體內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)的基礎(chǔ)，應(yīng)激反應(yīng)所導(dǎo)致的超生理劑量的糖皮質(zhì)激素是加速大腦尤其是海馬老化的主要原因。海馬是與記憶和思維有關(guān)的主要腦區(qū)，存在著高密度的糖皮質(zhì)激素受體，如果體內(nèi)的皮質(zhì)激素的含量長(zhǎng)期處在平衡失調(diào)的狀態(tài)，則可使海馬神經(jīng)元易于發(fā)生應(yīng)激性反應(yīng)損傷，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的變性和壞死3。三臂電迷宮法是常用的測(cè)試動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶力高低的方法，此法主要是通過觀察動(dòng)物面對(duì)危險(xiǎn)時(shí)所

19、產(chǎn)生的被動(dòng)和主動(dòng)逃避反射獲得能力和再現(xiàn)能力來判斷藥物對(duì)學(xué)習(xí)記憶力的影響，在給提示和不給提示的測(cè)試中，如果用藥動(dòng)物正確率比非用藥動(dòng)物明顯提高，則提示藥物具有顯著的益智作用，反之亦然。腦組織中MAO，SOD和AchE是與生物體衰老之間關(guān)系密切的3種主要的酶。在新陳代謝過程中產(chǎn)生的自由基過量會(huì)造成DNA和其他大分子損傷，引起生物體衰老死亡，機(jī)體對(duì)抗自由基損傷的機(jī)制主要有兩種，一是對(duì)損傷大分子的修復(fù)機(jī)制，二是消除自由基機(jī)制4。在體內(nèi)，最有效的自由基消除劑就是SOD，它的含量降低提示體內(nèi)過氧化反應(yīng)明顯，機(jī)體出現(xiàn)老化現(xiàn)象。MAO可降解腦內(nèi)的兒茶酚胺含量，使腦活動(dòng)降低，被認(rèn)為是老化的標(biāo)志。乙酰膽堿（Ach）

20、是最古老的遞質(zhì)，其主要功能是作為神經(jīng)傳導(dǎo)的化學(xué)遞質(zhì)，在體內(nèi)的主要滅活方式是靠乙酰膽堿酯酶(AchE)的作用。文獻(xiàn)5報(bào)道在Alzheimer病患者中，發(fā)現(xiàn)主要與識(shí)別和記憶功能有關(guān)的基底前腦中膽堿能神經(jīng)元發(fā)生選擇性退行性變，皮層和腦脊液中AchE活性降低。本實(shí)驗(yàn)研究中予大鼠超生理劑量的潑尼松灌喂3個(gè)月后也觀察到大鼠記憶力和反應(yīng)性下降，海馬結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生水腫和變性，皮層厚度下降，單位面積里的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，單胺氧化酶含量增加，超氧化物歧化酶和乙酰膽堿酯酶減少，提示長(zhǎng)期超生理劑量應(yīng)用潑尼松可造成自由基大量堆積，加速了腦內(nèi)兒茶酚胺的降解，導(dǎo)致腦神經(jīng)遞質(zhì)含量紊亂，對(duì)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的毒性

21、作用。健腦膠囊是由丹參、淫羊藿、黃芪、甘草為主的等幾種中藥組成的復(fù)方，實(shí)驗(yàn)研究提示，健腦膠囊對(duì)由潑尼松引起的大鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有良好的保護(hù)作用，可以明顯地提高三臂迷宮的成功率，增加腦勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）和乙酰膽堿酯酶（AchE）的含量，降低單胺氧化酶（MAO）的含量。在健腦膠囊中，丹參是經(jīng)典的抗衰老的中藥，具有鎮(zhèn)靜安神，改善中樞神經(jīng)功能的作用，同時(shí)丹參可明顯改善腦部血液供應(yīng)以及腦缺血后大腦中單胺類物質(zhì)的代謝紊亂，對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)和血管活性物質(zhì)也有很好的調(diào)節(jié)作用6，可顯著改善神經(jīng)肽和興奮性氨基酸的含量以及消除腦中氧自由基的含量 7。 淫羊藿是具有抗衰老作用的藥物，在體內(nèi)可提高SOD的含量，有效清除代謝產(chǎn)生的自由基，對(duì)機(jī)體有一定的保護(hù)作用；另一方面，淫羊藿8可增加腦血流量、降低腦血管阻力，從而增加神經(jīng)細(xì)胞的血供，起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。黃芪具有延年益壽、直接抗衰老作用，可以增加血中和腦中SOD的含量9，甘草性平和，有促進(jìn)各種藥效的作用。因此，健腦膠囊對(duì)潑尼松大鼠的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用主要是通過調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)遞質(zhì)的含量，改善腦血供，加速