不同劑量脂多糖預(yù)處理對(duì)哮喘小鼠肺部炎癥的影響的研究

1、不同劑量脂多糖預(yù)處理對(duì)哮喘小鼠肺部炎癥的影響的研究                            作者：李鴻佳, 王淑娟, 李艷麗, 董亮【摘要】  目的: 研究不同劑量脂多糖（LPS）通過誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞（AM）Toll樣受體4（TLR4）的高表達(dá), 探討其對(duì)哮喘小鼠肺部炎癥的影響。方法: BALB/c小鼠隨

2、機(jī)分為哮喘模型組（OVA）A, 低劑量LPS處理組（0.1 mg/L LPS+OVA）B, 高劑量LPS處理組（100 mg/L LPS+OVA）C, 對(duì)照組（生理鹽水）D。用卵白蛋白（OVA）致敏與激發(fā)建立小鼠哮喘模型; 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)各組小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）上清中IL4、 IL5、 IL13和IFN的含量, 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定AM的TLR4的表達(dá), 光鏡觀察肺組織病理變化。結(jié)果: 與A組相比較, B組BALF上清中IL4、 IL5和IL13的水平顯著增高（P<0.05）, 而IFN差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）, C組BALF上清中IL4

3、、 IL5和IL13的水平顯著降低, IFN顯著增高（P<0.05）; 與A組相比, B組與C組AM的TLR4mRNA表達(dá)均明顯增高（P<0.05）, 兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 光鏡下, A組支氣管黏膜下水腫, 黏液腺增生, 可見大量以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。B組與C組上述情況未見減輕, 并出現(xiàn)肺泡腔及間質(zhì)充血, 中性粒細(xì)胞等大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn), D組管腔內(nèi)無(wú)黏液栓, 氣道周圍無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn), 肺泡壁結(jié)構(gòu)完整。結(jié)論: 低劑量LPS(0.1 mg/L)誘導(dǎo)哮喘小鼠AM的TLR4高表達(dá), 使肺部炎癥加重, 而高劑量LPS(100 mg/L)可能會(huì)減輕變態(tài)反應(yīng)癥狀。 【關(guān)鍵詞】&

4、#160; 肺泡巨噬細(xì)胞; 脂多糖; Toll樣受體4; 支氣管哮喘    支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種以嗜酸性粒細(xì)胞為主的眾多炎癥細(xì)胞和炎癥因子參與的慢性氣道炎癥性疾病1, 其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì), 室內(nèi)灰塵, 革蘭陰性桿菌的內(nèi)毒素等在哮喘氣道炎癥中的作用存在很大的爭(zhēng)議。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌的一類重要的病原體微生物成分, 研究發(fā)現(xiàn), LPS濃度可影響Th1/Th2炎癥反應(yīng)。高水平LPS可使具有抗原特異性的Th1反應(yīng)增強(qiáng), 低劑量LPS可使Th2敏感性增高, 提示LPS可能在過敏性炎癥反應(yīng)中具有獨(dú)特的雙向作用2。TLR4是LPS的主要模式識(shí)別受體, T

5、LR4結(jié)合LPS等病原體相關(guān)分子模式后通過釋放細(xì)胞因子可促進(jìn)Th1細(xì)胞分化, 從而可能在哮喘免疫和宿主保護(hù)中起重要作用, 但目前尚沒有足夠證據(jù)證明TLR4能直接識(shí)別Th2型免疫應(yīng)答。我們?cè)噲D運(yùn)用不同劑量LPS干預(yù)小鼠哮喘模型, 研究LPS誘導(dǎo)AM表面TLR4激活機(jī)制, 探討TLR4激活在哮喘發(fā)病機(jī)制中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑, 進(jìn)一步明確其在哮喘小鼠氣道炎癥加重的機(jī)制中的作用。    1  材料和方法    1.1  材料  雞卵蛋白（OVA, Grade, 純度98%, Sigma）, 超純脂多糖(ultrapu

6、re LPS,  Ecoli O111: B4, Sigma), BALB/c小鼠(68周齡, 雌性)由山東大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供, 小鼠IFN和IL4 ELISA試劑盒購(gòu)自深圳晶美生物公司, 小鼠IL5和 IL13 ELISA試劑盒購(gòu)自上海西唐生物公司, 總RNA抽提與純化試劑盒購(gòu)自Roche公司, SYBR Green 購(gòu)自Roche公司, Spector型酶標(biāo)分析儀（美國(guó)）。    1.2  方法    1.2.1  動(dòng)物分組與模型建立  將40只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組, 每組10

7、只, A組為哮喘組,  B組為低劑量LPS處理組（0.1 mg/L  LPS+OVA）, C組為高劑量LPS處理組（100 mg/L  LPS+OVA）, D組為生理鹽水對(duì)照組。A組于第1(實(shí)驗(yàn)開始當(dāng)天)、 8 d分別腹腔內(nèi)注射OVA混懸液每次50  g, OVA/AL(OH)3為10 mg/g, 第15天將小鼠置于自制的有機(jī)玻璃盒中, 給予霧化吸入OVA(10 g/L OVA/PBS), 每天30 min, 連續(xù)1周。D組致敏與激發(fā)均以生理鹽水代替OVA。B組和C組分別在致敏階段每隔2 d腹腔注射1 mL含0.1、 100  g 

8、Ecoli LPS, 激發(fā)階段在每次激發(fā)前1 h腹腔注射相同劑量濃度Ecoli LPS。各組小鼠在末次激發(fā)24 h以后處死。    1.2.2  BALF標(biāo)本的收集  對(duì)小鼠行氣管插管, 在左主支氣管處結(jié)扎左肺, 用3 mL冰磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)分3次灌洗右肺, 回收液體量>80%為合格, 約2.5 mL/鼠, 1 000 r/min, 離心10 min, 4 離心, 收取各組細(xì)胞上清液, -80保存待測(cè)。    1.2.3  AM的分離與培養(yǎng)  BALF離心后沉淀用生理鹽水3 mL重

9、懸、 再離心, 反復(fù)洗滌3次, 然后用RPMI1640培養(yǎng)液（含2 mmol/L谷胺酰氨, 100 mL/L胎牛血清, 100 U/L青霉素, 100 U/L鏈霉素）4 mL混懸細(xì)胞, 于孵箱中37、 50 mL/L CO2孵育2 h后, 輕輕吸出上清, 去除非貼壁細(xì)胞。用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸, 調(diào)整細(xì)胞濃度為108/L, 培養(yǎng)24 h, 以Giemsa染色法鑒定AM, 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)其活性。    1.2.4  AM總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄  按TRIzol一步法RNA提取試劑盒說明書提取RNA。抽提出的RNA經(jīng)

10、紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度, A260/A280為1.9。逆轉(zhuǎn)錄條件為42 1 h, 70 10 min, 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。    1.2.5  實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Realtime fluorescence quantitative PCR）檢測(cè)基因表達(dá)  目的基因TLR4,  F 5CAGAACTTCAGTGGCTGGA3, R 5ATTTTGTCTCCACAGCCACC3（180 bp）; 內(nèi)參照actin, F 5CCTTCCGTGTTCCTACCCC3, R 5GCCCAAGATGCCCTTCAGT3（131 bp）。

11、實(shí)時(shí)定量PCR樣品反應(yīng)體系采用SYBR Green , 其最終的反應(yīng)體系為20 L, 循環(huán)條件為: 92 120 s, 92 5 s, 60 60 s, 40 5 s進(jìn)行45個(gè)循環(huán), 所有循環(huán)結(jié)束后, 繪制溶解曲線判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。每個(gè)樣品均設(shè)置相應(yīng)未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的模板作為陰性對(duì)照, 繪制actin、 TLR4的熒光曲線和溶解曲線, 并得到各自的熒光域值循環(huán)數(shù)(Ct值), 其均值的比值。    1.2.6  BALF上清中細(xì)胞因子的檢測(cè)  IL4、 IL5、 IL13、 IFN的測(cè)定采用小鼠ELISA 檢測(cè)試劑盒, 按試劑盒說明書進(jìn)行操作, 根

12、據(jù)光密度值（A）計(jì)算含量。    1.2.7  肺組織病觀察  小鼠處死后, 打開胸腔, 切取未行支氣管肺泡灌洗的左肺近肺門組織, 40 g/L多聚甲酸溶液固定24 h, 常規(guī)石蠟包埋, 蘇木素伊紅（HE）染色, 在擴(kuò)大400倍的顯微鏡下觀察小鼠肺組織和黏膜上皮的炎癥浸潤(rùn)情況。    1.2.8  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析  檢測(cè)結(jié)果均以x±s表示, 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。多組間比較采用單因素方差分析, 兩組間比較采用NK檢驗(yàn),  P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1 &#

13、160;           2  結(jié)果    小鼠哮喘模型造模成功, 出現(xiàn)明顯的煩躁不安, 呼吸急促, 腹肌抽搐, 大、 小便失禁, 毛發(fā)豎起, 部分小鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍, 動(dòng)作遲緩; 而生理鹽水對(duì)照組小鼠無(wú)明顯異常表現(xiàn)。    2.1  小鼠肺組織病改變  高倍顯微鏡下觀察可見, A組支氣管黏膜下水腫, 黏液腺增生, 黏膜皺褶增多, 黏膜及黏膜下層、 平滑肌外均可見大量以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn), B

14、組與C組上述情況未見減輕, 并出現(xiàn)肺泡腔及間質(zhì)充血, 中性粒細(xì)胞等大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn), D組氣道上皮無(wú)增厚, 氣道周圍無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn), 肺泡壁結(jié)構(gòu)完整（圖1）。    圖1  肺組織病理切片（HE染色, ×400）    2.2  小鼠BALF細(xì)胞因子水平的檢測(cè)  A組肺泡灌洗液上清中IL4、 IL5、 IL13和IFN的水平顯著高于D組（P<0.05）; 與A組相比, C組IL4、 IL5和IL13水平顯著降低, IFN水平顯著升高（P< 0.05）, B組IL4、 IL5和IL1

15、3水平顯著增高（P<0.05）, 而IFN差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。表1  BALF中IFN、 IL4、 IL5和IL13含量    2.3  小鼠AM中TLR4mRNA的表達(dá)情況  與A組相比,  B組與C組TLR4mRNA表達(dá)能力顯著增強(qiáng)（P<0.05）, 而D組與A組TLR4mRNA表達(dá)能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。表2  AM中TLR4mRNA的熒光域值循環(huán)數(shù)    3  討論    哮喘的主要特征是慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性

16、, 其發(fā)病及演變主要受控于Th2型細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子1。室內(nèi)灰塵, 革蘭陰性桿菌的內(nèi)毒素等在哮喘氣道炎癥中的作用存在很大的爭(zhēng)議, LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌的一類重要的病原體微生物成分, 近年來(lái)TLRs的發(fā)現(xiàn)為機(jī)體對(duì)LPS的免疫應(yīng)答提供了新的線索2。    AM是一類重要的抗原提呈細(xì)胞, 其表面的TLR4作為L(zhǎng)PS的主要跨膜受體, 介導(dǎo)了肺部的炎癥反應(yīng), 首先形成的LPS/LBP/CD14復(fù)合物, 在MD2的輔助下, 通過接頭蛋白MyD88（myeloid differentiation protein, 髓樣分化蛋白）, 使IRAK(IL1 receptor ass

17、ociated kinase, IL1受體相關(guān)激酶)、 TRAF（TNF receptor associated factor, 腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子）6、 MAPKKK(MAPK kinase kinase)家族依次活化, 從而激活NIK（NFB誘導(dǎo)激酶）、 IKK（IB激酶）, 使NFB解除抑制入核轉(zhuǎn)錄3, 4; TRAF6還可通過激活MAPKKK、 MAPKK、 ERK、 P38和JNK/SAPK通路, 最后導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子AP1家族的成員jun和fos活化5, 進(jìn)而誘導(dǎo)各種炎癥因子如TNF、 IL1、 IL6等大量釋放, 加重了肺部炎癥。    我們通過建

18、立不同濃度LPS預(yù)處理的哮喘小鼠模型, 發(fā)現(xiàn)兩組LPS預(yù)處理的小鼠, AM的TLR4mRNA表達(dá)與哮喘模型組相比均明顯增強(qiáng), 而不同劑量LPS處理的哮喘小鼠之間, AM的TLR4mRNA表達(dá)差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 提示我們AM的TLR4是LPS引起免疫應(yīng)答的主要受體, LPS可誘導(dǎo)哮喘小鼠AM的TLR4mRNA的表達(dá)上調(diào), 而OVA并不能刺激TLR4mRNA表達(dá)增強(qiáng), 這與Eswarappa等7的研究相一致。    同時(shí)發(fā)現(xiàn)LPS暴露水平可以決定機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的類型6, 暴露于含高濃度LPS（100 mg/L）的OVA的小鼠, 其氣道的變態(tài)反應(yīng)癥狀減輕, 主要以中

19、性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主, 粘液分泌不明顯, Th1型細(xì)胞因子IFN明顯增加, 主要與肺損傷有關(guān); 而暴露于含低濃度LPS（0.1 mg/L）的OVA的小鼠, 其哮喘癥狀加重, 肺部以嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主, 粘液分泌增加, 抗原特異性Th2型細(xì)胞因子IL4、 IL5和IL13明顯增加8, 這使得衛(wèi)生學(xué)假說對(duì)于內(nèi)毒素的暴露使Th平衡向著減弱Th2型的方向的理論, 在哮喘的發(fā)病機(jī)制中還需進(jìn)一步深入研究, 我們推測(cè)這可能與重癥哮喘以及哮喘的急性發(fā)作密切相關(guān), 這有待于我們?cè)囼?yàn)的進(jìn)一步探討與證實(shí)。【】  1 Goetzl EJ. Changing paradigms in the imm

20、unological science of allergy: 2008J. Curr Allergy Asthma Rep, 2008, 8(1): 28-31.2 Hollingsworth JW, Whitehead GS, Lin KL, et al. TLR4 signaling attenuates ongoing allergic inflammationJ. Immunol, 2006, 176(10): 5856-5862.3 Noulin N, Quesniaux VF, SchnyderCandrian S, et al. Both hemopoietic and resi

21、dent cells are required for MyD88dependent pulmonary inflammatory response to inhaled endotoxinJ. Immunol, 2005, 175(10): 6861-6869. 4 Chen F, Du Y, Zhang Z, et al. Syntenin negatively regulates TRAF6mediated IL1R/TLR4 signalingJ. Cell Signal, 2008, 20(4): 666-674.5 Koch A, Knobloch J, Dammhayn C, et al. Effect of bacter