人參皂苷溶血作用規(guī)律及其注射劑溶血成分研究

1、人參皂苷溶血作用規(guī)律及其注射劑溶血成分研究    0 引言人參皂苷是五加科人參屬人參（Panax ginseng C.A.Meyer）、西洋參（Panax quinquefoliumL.）和三七（Panax notoginseng）的主要活性成分，目前，已經(jīng)確定的人參皂苷有40 多種。溶血是皂苷的特性之一，多種皂苷具有溶血作用，致使皂苷類注射劑產(chǎn)生溶血副作用，這也是限制皂苷類注射劑廣泛應用的最大障礙之一1。一般認為皂苷的溶血是其與血紅細胞壁上的膽甾醇結(jié)合生成不溶性分子復合物沉淀，造成血紅細胞正常滲透性被破壞而發(fā)生崩解2。人參總皂苷并沒有顯示明顯的溶血作用

2、2，但經(jīng)分離純化后的單體皂苷卻分別具有截然相反的溶血和溶血保護作用，而且其溶血和溶血保護作用的強弱和濃度之間存在著近似的曲線關(guān)系3。皂苷的溶血作用強弱通常采用溶血指數(shù)表示，上世紀70 年代日本學者難波恒雄通過體外溶血實驗對7 種單體皂苷的溶血特性進行了測定4。由于測定溶血度方法很多5-7，并且如反應體系的溫度、藥物濃度、反應時間等因素均會對溶血度造成較大的影響，因此有關(guān)含皂苷類中藥的溶血反應的測定尚未見統(tǒng)一標準。目前，含皂苷類成分尤其是人參皂苷的中藥注射劑臨床應用較普遍，如血塞通注射劑的主要成分是三七總皂苷，經(jīng)測定，血塞通注射劑中人參皂苷-R1，人參皂苷-Rb1，人參皂苷-Re，人參皂苷-Rg

3、1 和人參皂苷-Rd 含量較高，為主要皂苷成分。此類注射液在應用中的一個重要問題是產(chǎn)生溶血不良反應。因此建立此類注射劑中溶血性成分的判定方法有利于控制其溶血不良反應的發(fā)生。我們首先規(guī)范了皂苷溶血評價體系，然后對人參皂苷的單體及相互作用引起的溶血反應的機理進行研究。同時，以血塞通注射液為研究對象，運用統(tǒng)計學方法對血塞通注射液中引起溶血反應的物質(zhì)進行分析。0.1 實驗材料0.1.1 儀器和動物Sartorius CP225D 型精密天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），TDZ4-WS 低速臺式離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司），Matrix 移液器，Thermo 可調(diào)式移液器（熱電儀器有限公司）

4、，UV-2100 紫外分光光度計（上海UNICO 公司），U-3010 紫外分光光度計（日本日立公司），Agilent 1100 series 高效液相色譜儀（美國安捷侖科技有限公司），PHS-3C 型精密數(shù)顯酸度計（上?？祵庪姽饧夹g(shù)有限公司），Motic BA200 數(shù)碼顯微鏡（廈門麥克奧迪實業(yè)集團），家兔（購于大連大學實驗動物中心）。0.1.2 試劑氯化鈉注射液（赤峰榮濟堂藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)批號10020011），磷酸鹽緩沖溶液（簡稱PBS）自制，人參根部總皂苷樣品自制，血塞通注射液購于各醫(yī)藥公司，Rg1 標準品（中國藥品生物制品檢定所）；甲醇，乙腈等試劑購于天津市科密歐化學試劑有限公司

5、。1 人參皂苷溶血條件的確定目前主要測定注射劑溶血的方法有目視比色法、顯微細胞計數(shù)法和分光光度法。中國藥典主要采用第一種方法，我們通過實踐發(fā)現(xiàn)這種方法不能給出定量關(guān)系。第二種方法精密度較差，而且費時、費力。而第三種方法具有較好的精密度和重現(xiàn)性。因此我們確定了第三種方法。通過對溶血實驗有影響的幾個因素（最大吸收波長、血細胞保存條件、血細胞濃度、水浴時間、離心速度、離心時間、反應體系pH 值）進行考查，參照文獻8建立最優(yōu)的溶血實驗評價方法。如下：取2.5mL1.1%兔紅細胞（全溶血吸光度值為1.0，溶液為生理鹽水），加入不同濃度的藥品溶液，以生理鹽水定容6mL，37保溫120min 后，3000r

6、/min離心10 分鐘，取上清液，比色測定，檢測波長575nm。溶血度（%）=（A 藥品A 空白）/（A100%溶血A 空白）×100%。陽性對照組為2.5mL1.1%血細胞加入到蒸餾水，陰性對照組為2.5mL1.1%血細胞加入到生理鹽水。同時對該方法的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性進行考察，其RSD 分別為1.66%及1.99%，表明本條件重現(xiàn)性良好。2 人參皂苷溶血規(guī)律研究2.1 對照皂苷（saponin）半數(shù)溶血濃度（HD50）值測定按照上述溶血度測定方法，在刻度離心管中分別加入不同濃度的Saponin 溶液。Saponin濃度的對數(shù)值（logC）為橫坐標，溶血百分數(shù)（A%）為縱坐標，擬合對數(shù)

7、濃度溶血百分數(shù)曲線，并計算其半數(shù)溶血濃度（HD50），見Fig. 1。標準皂苷 Saponin 半數(shù)溶血濃度（HD50）為2.23g/ml。曲線表明Saponin 皂苷在濃度較低時溶血現(xiàn)象不明顯，隨著濃度的增加，溶血比例迅速增大，且在半數(shù)溶血時濃度的變化對溶血影響最為靈敏，直到血細胞全部發(fā)生溶血。2.2 單體人參皂苷溶血規(guī)律的測定2.2.1 人參皂苷半數(shù)保護量（P50）的測定在刻度離心管中加入不同濃度有抗溶血作用的人參皂苷溶液和一定濃度的Saponin 溶液（反應液中Saponin 的濃度為其HD50 即2.23g /mL），按照上述方法測量溶血度。保護皂苷濃度（C）或其濃度的對數(shù)值（logC

8、）為橫坐標，抗溶血百分數(shù)（記為PA%，PA%=1-A%）為縱坐標，計算半數(shù)保護濃度（P50）。2.2.2 人參皂苷半數(shù)溶血量（HD50）的測定采用上述方法測定不同人參皂苷的半數(shù)溶血濃度，結(jié)果見Tab. 1。Saponin 被認為是具有強溶血作用的混合皂苷，在本實驗中作為對照皂苷。由于曲線上通過HD50 或 P50 所對應點的切線斜率最大，即皂苷濃度在HD50 或 P50 附近變化時對溶血結(jié)果影響最大，故選取半數(shù)濃度作為皂苷溶血或抗溶血作用強弱的指標。我們將Saponin 半數(shù)溶血濃度所產(chǎn)生溶血的效果設(shè)定為其他人參皂苷溶血或抗溶血作用測定時溶血或抗溶血的上限值，即溶血或抗溶血作用的最大值等于對照

9、皂苷HD50 濃度造成的溶血度值。由于此上限值隨著操作誤差大小變化較靈敏，可通過準確把握這個標準值來確保對實驗操作準確性的監(jiān)測。兩種截然相反的作用結(jié)果用同一標準作對照表示出來，這使得單體人參皂苷溶血或抗溶血作用的強弱在數(shù)值上具有了一定的可比性。幾種人參皂苷的溶血作用和抗溶血作用曲線都具有相似的S 形關(guān)系曲線，與文獻報道的曲線近似4，提示人參皂苷的溶血和抗溶血作用機理相似或相同。2.2.3 溶血與抗溶血單體皂苷相互作用與溶血效果的關(guān)系1）在10 支刻度離心管中均加入同一濃度的Rd 和不同濃度的Rc，混合均勻后再加入1.1%的紅細胞懸濁液1.25mL，使三者體積之和為6mL 并且Rd 的濃度為35

10、0g/mL（接近其HD50 值），Rc 的濃度分別為09g/mL，濃度跨度為其P0P100 值。按照測定方法，以不含皂苷的陰性實驗組上清液為空白，Rc 的濃度為0 的實驗組為100對照，紫外分光光度計575nm 測定吸光度并計算溶血度。2）在10 支刻度離心管中均加入同一濃度的Rd 和不同濃度的Rg1，混合均勻后再加入1.1%的紅細胞懸濁液1.25mL，使三者體積之和為6mL 并且Rd 的濃度為350g/mL（接近其HD50 值），Rg1 的濃度分別為0400g/mL，濃度跨度為其P0P100 值。按照測定方法，以不含皂苷的陰性實驗組上清液為空白，Rg1 的濃度為0 的實驗組為100對照，紫外

11、分光光度計575nm 測定吸光度并計算溶血度。人參皂苷相互作用相互作用引起的紅細胞溶血特性進行研究結(jié)果顯示Rc 在1g/mL 的濃度（對Saponin 無保護作用）即可起到對Rd 半數(shù)溶血濃度的保護作用。而Rg1 的濃度為400g/mL 時（對Saponin100保護作用）仍未起到對Rd 半數(shù)溶血濃度的保護作用，而且有隨濃度增大而助溶血的不明顯趨勢。3 血塞通注射劑主要成分含量的測定3.1 血塞通注射劑含量測定的方法學考察3.1.1 色譜條件經(jīng)方法學考查確定色譜條件為：色譜柱：phenomenex C18 柱 (4.6mm×250mm，5m)。流動相：A，水；B，乙腈。梯度洗脫：0-

12、12min，19B；12-60min，19-36B；60-75min，36%-50%B；75-85min，50%-65%B。流速：1.0ml/min。柱溫:25。進樣量:5l。紫外檢測波長:203nm。3.1.2 供試品和標準品的制備供試品的制備：取同一批次的血塞通注射液5 支混勻，用0.45m 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。標準品的制備：精密稱取R1，Re，Rg1，Rb1 及Rd，以色譜甲醇作溶劑，配制成1mg/mL的溶液，用0.45m 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。3.1.3 實驗結(jié)果根據(jù)各峰面積計算含量如下：4 血塞通注射劑溶血規(guī)律研究4.1 血塞通注射劑的分離取同一批次血塞通注射液50 支

13、 (約含三七總皂苷5g)，蒸干，用硅膠進行柱層析，氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，合并，得到5 個餾分，記為A-E。4.2 血塞通注射液溶血濃度測定上述方法測定血塞通注射液的HD50，其中8 號為陰性對照組，9 號陽性對照組。并計算溶血度。4.3 正交設(shè)計法探討血塞通注射劑溶血作用的規(guī)律4.3.1 供試品溶液的配制餾分A不能單獨溶解在生理鹽水中，故精密稱取A、B餾分按照原注射劑中的比例混合后作為一個因素，配置成4mg/mL的溶液。精密稱取餾分C、D和E，定溶，配置成4mg/mL的溶液。吡碇溶液不超過3%。4.3.2 注射劑中皂苷組分比例不同時溶血度的考察取22組實驗，1-16組中，每組分別加入注射劑溶

14、液、餾分A+B、餾分C、餾分D、餾分E、生理鹽水和2.5mL的1.1%的血細胞懸浮液，使每組總體積為6ml。17-20組只考察注射劑對溶血度的影響；21和22組分別為未加入皂苷的陰性對照組和全溶血的陽性對照組，測量其溶血度，4.3.3 皂苷含量和溶血度的量效關(guān)系考查1) 餾分A+B、C、D和E溶液的配置精確稱取餾分A餾分B，配置成3.3mg/mL的溶液備用。精稱餾分C、D、E，定容，分別配置成1.2、0.9及5.0mg/mL溶液備用。2) 皂苷和溶血度的量效關(guān)系考查取24個實驗組，按Tab.5 加入各餾分，測量各組的溶血度。3) 餾分B、C、D和E溶液的配置精確稱餾分B、C、D、E，定容配置成

15、8.1、4.0、2.5及25mg/mL的溶液備用。4) 加入餾分B、C、D和E考察皂苷和溶血度的量效關(guān)系按Tab.6 加入各餾分，考察不同餾分比例對溶血度的影響。5) HPLC法測定各實驗組組分濃度綜合上表，按與上述實驗方法相同濃度配比，用色譜甲醇代替生理鹽水為溶劑，依照血塞通注射液液相色譜條件，進樣量為10L，進行HPLC定量分析，得到各峰面積并計算濃度值。4.4 實驗數(shù)據(jù)處理血塞通注射液中多種皂苷的含量視為自變量，溶血度視為應變量，利用統(tǒng)計分析的手段研究多種皂苷含量的變化與溶血度之間的線性關(guān)系。多種成分的濃度數(shù)據(jù)在EXCEL 中進行平方項和相關(guān)項處理，即分別計算出x12，x22xn2 和x

16、1*x2，x1*x3xn-1*xn。4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析4.5.1 相關(guān)分析分別以單體濃度溶血度及單體化合物所占總皂苷的百分含量溶血度的關(guān)系進行相關(guān)分析，結(jié)果得到以下結(jié)論。1）各單體化合物在反應體系中的濃度與溶血度的相關(guān)分析結(jié)果顯示Rg1，Rg2，m51對溶血度有顯著的正相關(guān)，m70對溶血度有正相關(guān) (m51，m70分別代表在HPLC譜圖中保留時間為51min，70min的微量成分)。即當上述4種單體成分的濃度增大時血紅細胞的溶血度升高。2）各單體化合物所占總皂苷的百分含量與溶血度之間的相關(guān)分析結(jié)果顯示，溶血度與R1、Re、Rb1、Rd所占總皂苷的百分含量呈現(xiàn)負相關(guān)，與Rg1、Rg2、m51及

17、m70所占總皂苷百分含量呈現(xiàn)正相關(guān)。即在上述濃度變化范圍內(nèi)R1、Re、Rb1、Rd百分含量越高則對紅細胞保護溶血的作用越強，而Rg1、Rg2、m51及m70百分含量越高則對紅細胞溶血的作用越強。3）采用上述兩種統(tǒng)計指標對數(shù)據(jù)進行分析，具有一致性，同時結(jié)合單體人參皂苷溶血及抗溶血作用規(guī)律研究結(jié)果，結(jié)果顯示采用相關(guān)分析統(tǒng)計的結(jié)果與實驗結(jié)論基本相同。因此，可以確定血塞通注射液中Rg1、Rg2、m51 及m70 四種成分是引起注射液溶血的主要成分。4.5.2 多元線性回歸統(tǒng)計對數(shù)據(jù)進行分析，由于本實驗統(tǒng)計的是注射劑中成分變化對溶血度的影響，因此首先將各數(shù)據(jù)標準化，標準化公式為(X- x )/SD，采用

18、多元線性回歸的逐步回歸分析方法，擬合回歸方程，在總體上模擬不同組分組成的注射液與其溶血度間的數(shù)量關(guān)系，確定自變量或自變量的組合對溶血產(chǎn)生的影響。用 SPSS 軟件處理上標準化實驗數(shù)據(jù)，得到了方差分析、T 檢驗、線性回歸方程和判定系數(shù)等信息。統(tǒng)計結(jié)果如下：1）未經(jīng)標準化的樣本回歸方程為Y=19.887+16.526m51+54.139Rg2-74.187Rg2*m71+6.957Rg1*m73-26.862R1+34.530Rg2*Rd，(Y 為溶血度)。由此看來決定注射劑溶血的因素既有含量較高的成分，又有含量較低的成分。從前面結(jié)論可以看出，-Rg2 本身由于半數(shù)溶血濃度較低，在溶血測定中起主要

19、作用。2）回歸方程通過了總檢驗（根據(jù)方差分析表），因為F 統(tǒng)計量對應的P 值等于0，小于任何給定的顯著性水平（最小的顯著性水平為1%），所以拒絕所有回歸系數(shù)同時等于零的假設(shè)，說明從整體上看，R1、Rd、Rg1、Rg2、m51、m71、m73 作為一個整體之間存在線性關(guān)系。3）m51、Rg2、Rg2*m71、Rg1*m73、R1、Rg2*Rd 它們的回歸系數(shù)分別通過了t 檢驗，它們的t 統(tǒng)計量分別為4.989、6.012、-6.620、2.786、-2.953、2.269，對應的P 值分別為.000，.000.000、.010、.006、.032 小于任何給定的顯著性水平，所以分別拒絕兩個回歸系

20、數(shù)等于零的假設(shè)。4）從標準化的回歸系數(shù)（經(jīng)標準化回歸系數(shù)是把所有的變量標準化以后，再應用OLS估計得到的系數(shù)）可以看出，在得到的六個自變量中，按照Rg2*m71，Rg2，Rg2*Rd，R1，m51，Rg1*m73 的順序?qū)θ苎鹊挠绊懓磸拇蟮叫∨帕?。說明Rg2 對溶血度Y 值的正向影響最大，而Rg2*m71 對對溶血度Y 值的負向影響最大。5）未經(jīng)調(diào)整的判定系數(shù)等于84.1%，說明在溶血度的變動中有84.1%是由m51、Rg2、Rg2*m71、Rg1*m73、R1、Rg2*Rd 的變動導致的。經(jīng)調(diào)整后的判定系數(shù)為80.6%，其意義和解釋與未經(jīng)調(diào)整的判定系數(shù)相同，一般情況下后者會小于前者。估計標

21、準誤差為10.4842661，方程顯著性概率sig=0.032<0.05，為顯著。5 結(jié)論1. 通過對溶血實驗有影響的幾個因素進行考查，建立最優(yōu)的溶血實驗評價方法，方法簡述如下：取2.5mL1.1%兔紅細胞（全溶血吸光度值為1.0，溶液為生理鹽水），加入不同濃度的藥品溶液，以生理鹽水定容6mL，37保溫120min 后，3000r/min 離心10 分鐘，取上清液，比色測定，檢測波長575nm。溶血度（%）=（A 藥品A 空白）/（A100%溶血A 空白）×100%。此方法測定的溶血度的穩(wěn)定性及重復性的RSD 分別為1.66%及1.99%，表明該方法穩(wěn)定及重現(xiàn)性良好。目前中國藥

22、典采用目視比色法，方法誤差和人為因素較大，而且不能量化。建議采用分光比色法考查注射劑半數(shù)溶血濃度作為注射劑溶血控制指標。2. 通過多種人參皂苷的溶血和溶血保護特性的研究，發(fā)現(xiàn)人參單體皂苷的溶血作用規(guī)律如下：1）皂苷可分為溶血性皂苷和抗溶血性皂苷兩類；2）溶血性皂苷在高濃度具有溶血作用，低濃度具有抗溶血作用；3）高濃度不溶血的皂苷（抗溶血皂苷），低濃度都具有一定的溶血保護作用；4）含糖較少的皂苷溶血性較強。3. 對影響注射劑溶血的因素進行研究，總結(jié)如下：1）皂苷類成分一般在高濃度具有溶血特性，低濃度具有溶血保護特性。皂苷類注射劑本身可以引起注射劑溶血，尤其是濃度較高情況下；2）注射劑輔料也可引起

23、溶血，當pH 值等因素變化時，尤其明顯。4. 皂苷類注射劑溶血是一個復雜體系，皂苷和輔料都可以引起溶血。就皂苷本身而言，在控制溶血的關(guān)鍵因素中既有含量較高的成分，又有含量較低的成分，同時由于皂苷相互作用引起的溶血反應并非是單體皂苷作用的加減，因此通過改變注射劑中單體皂苷濃度，通過統(tǒng)計方法分析可確定血塞通注射液中溶血的相關(guān)因素。本方法簡便實用，具有其他實驗方法不能比擬的優(yōu)勢。溶血性因素的確定對于進一步注射劑的不良反應控制具有重要意義。中國醫(yī)學論文網(wǎng)專業(yè)提供醫(yī)學論文發(fā)表服務，并提供大量藥學論文，如有業(yè)務需求請咨詢網(wǎng)站客服人員！參考文獻 (References)1 孟勤，孫平，王陸黎，等. 人參、西

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