夏至草醇提物對休克大鼠自由基損傷的影響

1、夏至草醇提物對休克大鼠自由基損傷的影響                      作者：張有成 韓瑞，侯亞利，李寶亮，牛發(fā)良，趙自剛 牛春雨【摘要】  目的觀察夏至草醇提物對失血性休克大鼠多器官自由基損傷的影響。方法Wistar雄性大鼠18只，隨機分為夏至草組、模型組和對照組（均n=6）。夏至草組和模型組復制失血性休克模型，維持90 min，對照組僅手術(shù)。夏至草組自頸靜脈緩慢推

2、注夏至草醇提物（5 g/ml，6 g/kg·bw），其它兩組以等量生理鹽水代替。40 min后，制備肝、腎、心肌、肺組織勻漿，觀察組織勻漿自由基指標的變化。結(jié)果與對照組相比，模型組肝、腎、心肌、肺組織勻漿MDA含量顯著升高，SOD活性降低；夏至草組各器官組織勻漿MDA含量顯著低于模型組，SOD活性升高，除心肌組織勻漿SOD活性低于對照組外，其它各指標與對照組均無統(tǒng)計學意義。結(jié)論夏至草醇提物能明顯減輕大鼠重癥失血性休克后各器官的自由基損傷。 【關(guān)鍵詞】  夏至草 失血性休克 器官 自由基Abstract:ObjectiveTo observe the effects of e

3、thanol extract from Mrrubium incisum on free radical injury of organs in hemorrhagic shock rats. Methods18 male wistar rats were randomly divided into three groups: Mrrubium incisum group (n=6), model group (n=6) and control group (n=6). The hemorrhagic shock was established in Mrrubium incisum grou

4、p and model group for 90 min. Ethanol extract from Mrrubium incisum was venous injected in Mrrubium incisum group (5g/ml, 6g/kg·bw); in other groups ethanol extract from Mrrubium incisum was replaced by normal saline. After 40 min, the liver, kidney, cardiac muscle and lung were taken out for m

5、aking 10% homogenate, and the free radical indexes were determined in homogenate.ResultsThe MDA content of liver, kidney, cardiac muscle and lung homogenate in model group significantly increased, and SOD activity was significantly lowered as compared with control group. The MDA contents of liver, k

6、idney, cardiac muscle and lung homogenate in Mrrubium incisum group were significantly decreased, and SOD activities were significantly increased as compared with model group,and the indexes of Mrrubium incisum group were not statistical different as compared with control group, except the SOD activ

7、ity of cardiac muscle homogenate.ConclusionEthanol extract from Mrrubium incisum could markedly alleviate the free radical injury of organs in hemorrhagic shock rats.Key words:Mnubium incisum;  Hemorrhagic shock;  Organ;  Free radicals淋巴循環(huán)是循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分，近年來，淋巴循環(huán)維持機體穩(wěn)態(tài)和疾病中的作用逐漸受到重視1。失血性休

8、克（hemorrhagic shock）致組織微循環(huán)低灌注是引起肺、心、腎、肝等多個器官的功能障礙、誘發(fā)多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome, MODS）的主要因素之一。我室研究表明，淋巴微循環(huán)與休克的發(fā)生、及轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切2，良好的淋巴微循環(huán)有利于休克的代償，淋巴微循環(huán)障礙可促進休克的惡化3。夏至草具有利水消腫、活血化淤作用4，夏至草醇提物可明顯改善大鼠的淋巴微循環(huán)障礙5。本研究觀察了夏至草醇提物對失血性休克大鼠多器官自由基損傷的影響，旨在闡明夏至草對失血性休克以及淋巴微循環(huán)的藥作用。1  材料與儀器1.1  動物與分

9、組18只健康清潔級Wistar雄性大鼠（醫(yī)科院實驗動物繁育中心提供），體質(zhì)量220300 g。隨機均分為3組（均n=6）：對照組（僅行手術(shù)）、模型組（復制失血性休克模型，輸血加生理鹽水進行）、夏至草組（復制失血性休克模型，輸血加夏至草醇提物進行治療，MI）。實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水。1.2  藥品與儀器唇形科夏至草屬植物夏至草 Mrrubium incisum Benth 的全草（內(nèi)蒙古駐張家口醫(yī)藥站提供，經(jīng)河北北方學院中醫(yī)系姜希強教授鑒定），按6報道方法，制備夏至草醇提物，經(jīng)水煎醇沉，再經(jīng)活性炭脫色、滅菌制成原生藥含量為5 g·ml-1的注射液（pH、澄清度、溶血

10、實驗檢測均為合格）；戊巴比妥鈉（北京化學試劑廠生產(chǎn)，批號20000919）；肝素鈉（北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司生產(chǎn)，批號001218），F(xiàn)J-200型高速分散均質(zhì)機（上海標本模具廠），自動抽注機（浙江大學醫(yī)學儀器廠）。2  方法2.1  失血性休克模型的復制及液體復蘇所有大鼠肌注質(zhì)量分數(shù)2的戊巴比妥鈉（50 mg/kg）全身麻醉，無菌手術(shù)，行右側(cè)頸總動脈和左側(cè)頸靜脈插管，備放血及輸液用。舌靜脈注射質(zhì)量分數(shù)0.5%肝素（1 ml/kg，700 U/ml），全身抗凝。穩(wěn)定10 min后，經(jīng)自動抽注機自頸總動脈緩慢放血（失血量以全血量的1/5計，全血量以體重1/13計），3

11、min完成，保留備回輸用。以無菌林格式液瓶作為Lamson瓶，連接無菌輸液器，將液面調(diào)整至固定高度，維持低血壓（40 mmHg）90 min，復制大鼠重癥失血性休克模型7。然后，模型組、夏至草組以自動推注機自左側(cè)頸靜脈緩慢回輸放出之血液；輸血完畢后，夏至草組輸入6 g·kg-1劑量（生藥）的夏至草醇提物（輸前用生理鹽水等倍稀釋），模型組輸入等量的生理鹽水。對照組僅麻醉及頸部手術(shù)，不放血及輸液復蘇。2.2  組織勻漿標本的制備行液體復蘇后（或相當）3 h，分別處死動物。選擇固定的肝、腎、心、肺組織各0.81.0 g，加9倍的4無菌生理鹽水，應用FJ-200型高速分散均質(zhì)機低溫

12、制備10%組織勻漿，應用高速低溫離心機以2 500 r/min離心10 min（離心半徑8 cm），取上清液置于-26冰箱內(nèi)。2.3  組織勻漿MDA,SOD測定應用改良硫代巴比妥酸（TBA）微量法測定各臟器組織勻漿MDA含量、黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性（試劑盒購自南京建成生物工程研究所），嚴格按照試劑盒說明書要求進行操作。組織勻漿蛋白以考馬斯亮藍法進行定量。2.4  統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)以±s表示，經(jīng)SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包進行單因素方差分析，兩組間比較用兩樣本均數(shù)t檢驗，P<0.05為具有顯著性差異。1     

13、;    3  結(jié)果3.1  夏至草醇提物對失血性休克大鼠各器官組織勻漿MDA含量的影響模型組肝、腎、心肌、肺組織勻漿MDA含量均顯著高于夏至草組和對照組（P<0.01），而夏至草組肝、肺組織勻漿MDA含量與對照組比較無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。3.2  夏至草醇提物對失血性休克大鼠各器官組織勻漿SOD活性的影響模型組肝、腎、心肌、肺組織勻漿SOD活性均顯著低于對照組（P<0.01）；夏至草組除腎勻漿SOD活性低于對照組外（P<0.05），肝、心肌、肺組織勻漿SOD活性與對照組均無統(tǒng)計學差異

14、（P>0.05），且各器官組織勻漿SOD活性高于模型組（P<0.01）。見表2。表1  夏至草醇提物對休克大鼠各器官組織勻漿MDA含量的影響（略）表2  夏至草醇提物對休克大鼠各器官組織勻漿SOD活性的影響（略）4  討論失血性休克是臨床急癥，微循環(huán)障礙以及凝血功能紊亂是引起大鼠肺、腎、肝等多個器官的功能障礙、誘發(fā)多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome, MODS）的主要因素之一1。因此，從改善微循環(huán)障礙以及血液流變性異常來尋找藥物和其他有效措施正成為醫(yī)學研究的重要課題之一。夏至草具有利水消腫、活血

15、化淤作用6，前期工作研究表明5，靜脈推注不同劑量的夏至草醇提物可改善大鼠的淋巴微循環(huán)障礙，增強腸系膜淋巴管收縮頻率及幅度，腸淋巴流量、蛋白輸出量明顯升高，該作用在6 g/kg劑量時最顯著，1 g/kg劑量則對淋巴循環(huán)未發(fā)生影響，在一定范圍內(nèi)呈劑量效應關(guān)系。為此，本研究選擇了應用6 g/kg的劑量，從自由基損傷角度觀察夏至草醇提物對急性微循環(huán)障礙大鼠器官損傷的影響，闡明夏至草的藥作用，并為器官損傷的藥物提供實驗依據(jù)。自由基損傷在細胞損傷乃至器官功能障礙的發(fā)病學中具有重要作用8。研究結(jié)果表明，大鼠重癥失血性休克后，模型組肝、腎、心肌、肺組織勻漿自由基的代謝產(chǎn)物MDA含量均顯著升高，具有清除自由基功

16、能的SOD活性降低，結(jié)果提示失血性休克在引起大鼠急性微循環(huán)障礙的同時，加重了組織細胞的缺氧以及酸性產(chǎn)物潴留，加速了自由基的生成，這是引起自由基產(chǎn)生和釋放的重要原因9，表現(xiàn)在各臟器組織勻漿的自由基產(chǎn)物MDA含量增多，也加速了SOD的消耗；而過多的氧自由基進一步激活補體，補體系統(tǒng)被激活，補體活化產(chǎn)物（C3a，C3b，C5a等）可以刺激巨噬細胞和中性粒細胞釋放細胞因子和氧自由基，后者進一步通過膜脂質(zhì)過氧化作用攻擊內(nèi)皮細胞而加重損傷，形成細胞損傷的惡性循環(huán)。輸入夏至草醇提物后，各臟器組織勻漿MDA的含量均顯著低于模型組，SOD活性升高，結(jié)果提示輸入夏至草醇提物有效地減輕了失血性休克大鼠各重要器官的自由

17、基損傷，這主要是由于夏至草醇提物具有良好的改善微循環(huán)作用，減輕了休克時大鼠的急性微循環(huán)障礙，從而緩解了細胞的缺氧狀態(tài)，抑制了自由基釋放，使機體自由基的產(chǎn)生與清除趨于平衡，減輕自由基對組織細胞的損傷作用，最終達到了保護器官功能的作用。綜上所述，夏至草醇提物對失血性休克障礙大鼠具有較好的保護作用，其機制與夏至草醇提物有效改善微循環(huán)流態(tài)10，11、改善細胞缺氧狀態(tài)，從而減輕組織細胞的自由基損傷有關(guān)，這為深入研究夏至草醇提物的藥理學作用提供了實驗依據(jù)。以活血化淤類中藥為靶標，可為微循環(huán)障礙類疾病的治療開辟新途徑?！尽?#160; 1Fldi M. Lymphology in the second Mi

18、llenniumJ. Lymphology, 2001, 34(1):12.2張靜,姜 華,薄愛華.失血性休克時淋巴微循環(huán)的變化J.中華醫(yī)學雜志, 1991, 71(1): 24.3牛春雨,張 靜,穆 錚,等.不同轉(zhuǎn)歸的過敏性休克大鼠淋巴微循環(huán)的變化J.病理生理雜志, 1997,13 (6): 620.4李佳, 陳玉婷. 夏至草文獻考證J.中華醫(yī)史雜志, 2001,31(2):113.5牛春雨,李繼承,劉艷凱,等. 夏至草醇提物對大鼠淋巴循環(huán)作用的實驗研究J.中國藥學雜志, 2006, 41(12): 914.6顧學裘. 藥物制劑注解M.北京:人民衛(wèi)生出版社,1988:238.7牛春雨,李繼承,趙自剛,等. 腸系膜淋巴管結(jié)扎對失血性休克大鼠肺組織一氧化氮及其表達的影響J.中國危重病急救醫(yī)學, 2006, 18(9): 527.8王萬鐵,林麗娜,王 衛(wèi),等. 異丙酚對家兔肝缺血/再灌注后抗氧化能力改變的影響J.中國應用生理學雜志, 2005, 21(1