復(fù)方白毛夏枯草免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究

1、復(fù)方白毛夏枯草免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究                         作者：王文佳，李海峰，歐江琴，田維毅【摘要】  目的探討復(fù)方白毛夏枯草對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠免疫功能的影響。方法實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為復(fù)方白毛夏枯草大、中、小劑量組和生理鹽水對(duì)照組，給予相應(yīng)的藥物及生理鹽水灌胃7 d后，測(cè)定胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、EA花環(huán)形成率、吞噬細(xì)胞吞噬中性紅的能

2、力、脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力、血清IgG及IgM含量。結(jié)果與生理鹽水對(duì)照組比較，復(fù)方白毛夏枯草各組小鼠的胸腺及脾臟指數(shù)無(wú)明顯差異（P0.05）；腹腔巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯增加（P0.05），同時(shí)吞噬能力也明顯增強(qiáng)（P0.05或P0.001），以中、大劑量用藥組最顯著；血清中免疫球蛋白IgG的含量明顯升高（P0.05或P0.01），大劑量用藥組含量最高，而血清中免疫球蛋白IgM的含量無(wú)明顯變化（P0.05）；脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力有顯著提高（P0.01或P0.05或P0.001），以大劑量用藥組增殖最顯著。結(jié)論復(fù)方白毛夏枯草對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠免疫功能總體上表現(xiàn)為增強(qiáng)效應(yīng)。 【關(guān)鍵詞】  復(fù)方白毛夏枯草；

3、小鼠； 免疫調(diào)節(jié)          復(fù)方白毛夏枯草由苗藥白毛夏枯草、麥冬等組成，具有清熱解毒、止咳化痰、消腫潤(rùn)肺之功，是貴州省少數(shù)民族用于上呼吸道感染的經(jīng)驗(yàn)方，對(duì)上呼吸道感染引起的發(fā)熱、咽痛、久咳不止等癥效果尤為明顯。為探索該方的臨床療效機(jī)制，筆者對(duì)其免疫調(diào)節(jié)功能進(jìn)行初步研究，為其臨床應(yīng)用提供藥依據(jù)。1  材料與儀器1.1    動(dòng)物及分組  健康昆明種小鼠120只,體質(zhì)量(20±2)g,雌雄不分,貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格號(hào)為SCXK（黔

4、）2002-0001。隨機(jī)將小鼠分為4組，即復(fù)方白毛夏枯草大劑量組、中劑量組、小劑量和生理鹽水對(duì)照組，每組30只，雌雄分籠飼養(yǎng)。1.2  儀器與試劑 USA3131型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)熱電），EIX808U型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek）、BSC1800-A/B3型生物安全柜（上海瑞仰），小鼠IgG、IgM酶聯(lián)免疫試劑盒（批號(hào)分別為080418、080110,上海門(mén)諜塔生物科技有限公司）；四甲基偶氮唑鹽(MTT)（ Phamacia 公司），植物血凝素（PHA）（Sigma 公司），RPMI-1640營(yíng)養(yǎng)液（Serva 公司），中性紅(Amresco 公司) ,兔抗羊紅細(xì)

5、胞抗體（A）（河南知微生物工程有限公司），10%綿羊紅細(xì)胞懸液（E）、3%硫乙醇酸鈉溶液，Hank，s液，以上試劑均按常規(guī)方法配置。2  方法2.1  藥物及給藥方法 將復(fù)方白毛夏枯草各藥材依驗(yàn)方比例配伍，常規(guī)制備水煎劑，按成人臨床用藥量換成小鼠用藥量，調(diào)整濃度為大、中、小3個(gè)劑量（分別相當(dāng)于生藥1，0.5，0.25 g/ml）備用。各給藥組小鼠每次分別按10，5，2.5 g/kg灌服復(fù)方白毛夏枯草水煎劑，對(duì)照組代以等量生理鹽水，2次/ d，連續(xù)灌胃7 d。所有動(dòng)物按常規(guī)飼養(yǎng)。2.2  免疫指標(biāo)檢測(cè)2.2.1  胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)檢測(cè) 

6、;給藥結(jié)束次日，各組隨機(jī)取小鼠10只，摘眼球無(wú)菌取血并分離血清備用；同時(shí)，脊椎脫臼處死小鼠后，取胸腺、脾臟稱(chēng)濕重并胸腺和脾臟指數(shù)胸腺或脾臟質(zhì)量(g)與每100 g體質(zhì)量的比值。2.2.2  EA花環(huán)法測(cè)定巨噬細(xì)胞FC受體實(shí)驗(yàn)按照方法進(jìn)行1。在顯微鏡下，以周?chē)掣?個(gè)或5個(gè)以上EA的巨噬細(xì)胞為EA花環(huán)陽(yáng)性,隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)巨噬細(xì)胞，算出EA花環(huán)陽(yáng)性百分率。2.2.3  ELISA測(cè)定血清IgG、IgM 含量  使用上述血清0.1 ml,按照ELISA 試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定小鼠血清中IgG、IgM量。1      

7、60;  2.2.4  中性紅比色法檢測(cè)吞噬細(xì)胞吞噬能力 按方法2。在末次給藥后，各組隨機(jī)取小鼠10只，腹腔注射3%硫代乙醇酸鈉0.02 ml/g體質(zhì)量，6 h后無(wú)菌取腹腔液，常規(guī)制備小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,并調(diào)整濃度至1×106/ml，加至96孔板中，100 l/孔，置37、5%CO2培養(yǎng)箱貼壁孵育2 h，棄去上清，加0.072%中性紅溶液100 l/孔，繼續(xù)孵育30 min，棄去上清，以Hank's液洗3次，加入DMSO 100 l/孔，置4冰箱過(guò)夜，置酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定各孔OD值。2.2.5  MTT比色法測(cè)定脾臟淋巴細(xì)

8、胞增殖能力 文獻(xiàn)方法3。各組剩余小鼠末次給藥后2 h, 無(wú)菌取脾細(xì)胞，常規(guī)制備小鼠脾細(xì)胞懸液,并調(diào)整濃度至2×106/ml，加至96 孔培養(yǎng)板中l(wèi)00 l/孔,再加入含3%PHA完全RPMI-1640培養(yǎng)液100 l/孔,另設(shè)對(duì)照組加入不含PHA的完全RPMI-1640 培養(yǎng)液100l/孔，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置37、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)72h，吸上清液50l棄之,加入5 mg/ml的MTT10 l/孔, 置CO2 培養(yǎng)箱孵育6 h 后,加入DMSO 100 l/孔，充分振蕩后, 靜止10 min, 置酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定各孔OD值, 淋巴細(xì)胞增殖能力用PHA+與

9、PHA-的OD均值差表示。2.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組均數(shù)用±s表示，組間差異用SPSS 11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析。3  結(jié)果3.1  胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)與生理鹽水對(duì)照組比較，復(fù)方白毛夏枯草各組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均無(wú)明顯差異（P0.05）。見(jiàn)表1。表1  復(fù)方白毛夏枯草對(duì)小鼠免疫器官的影響（略）3.2  巨噬細(xì)胞FC受體 與生理鹽水對(duì)照組相比，復(fù)方白毛夏枯草小劑量組小鼠巨噬細(xì)胞FC受體的EA花環(huán)形成率無(wú)明顯差異(P0.05)，中、大劑量組EA花環(huán)形成率有明顯差異( P0.05)；復(fù)方白毛夏枯草各劑量組間EA花環(huán)形成率無(wú)明

10、顯差異(P0.05)。見(jiàn)表2。表2  復(fù)方白毛夏枯草對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞FC受體的影響（略）3.3  血清IgG、IgM 含量 與生理鹽水對(duì)照組比較，復(fù)方白毛夏枯草小、中劑量組小鼠血清中IgG含量有明顯差異( P0.05) ，大劑量有非常明顯差異( P0.01)；復(fù)方白毛夏枯草各劑量組間血清IgG含量無(wú)明顯差異(P0.05)；復(fù)方白毛夏枯草各劑量組血清IgM含量與生理鹽水組無(wú)明顯差異(P0.05)。見(jiàn)表3。表3   復(fù)方白毛夏枯草對(duì)小鼠血清中IgG和IgM含量的影響 （略）3.4  吞噬細(xì)胞 與生鹽水對(duì)照組比較，復(fù)方白毛夏枯草小劑

11、量組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力有明顯差異( P0.05) ，中、大劑量有非常顯著差異( P0.001); 與中藥小劑量組比較，中、大劑量組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力有非常顯著差異( P0.001)，但中劑量組與大劑量組間無(wú)明顯差異（P0. 05）。見(jiàn)表4。表4  復(fù)方白毛夏枯草對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬中性紅功能的影響（略）3.5  PHA刺激的脾細(xì)胞增殖能力與生理鹽水對(duì)照組比較，復(fù)方白毛夏枯草小劑量組有顯著差異( P 0.01)，中劑量有明顯差異( P 0.05)，大劑量組有非常顯著差異( P 0.001)；各劑量組間無(wú)明顯差異（P0.05）。見(jiàn)表5。4  討論  

12、60;     上呼吸道感染為臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，若經(jīng)久不愈，可為肺炎、哮喘等嚴(yán)重疾病4。本病多因機(jī)體抵抗力下降，病毒、細(xì)菌等病原體趁機(jī)感染機(jī)體，出現(xiàn)鼻塞、流涕、發(fā)熱、咳嗽、吐痰、咽痛等鼻腔、咽或喉部急性炎癥，屬中醫(yī)“外感”范疇，以“扶正祛邪”為根本大法。    復(fù)方白毛夏枯草由苗藥白毛夏枯草、麥冬等組成，是貴州苗族用于治療上呼吸道感染的驗(yàn)方，具有清熱解毒、止咳化痰、消腫潤(rùn)肺之功，對(duì)上呼吸道感染引起的發(fā)熱、咽喉腫痛、久咳等癥療效顯著。為探討該方療效機(jī)制，在前期抗菌作用研究的基礎(chǔ)上，筆者對(duì)其免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果顯

13、示，與生理鹽水對(duì)照組相比，復(fù)方白毛夏枯草中、大劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞EA花環(huán)形成率明顯增加（P0.05)，同時(shí)，復(fù)方白毛夏枯草各劑量組小鼠吞噬細(xì)胞吞噬能力都有明顯升高（P0.05或P0.001)，提示該方可提升實(shí)驗(yàn)小鼠巨噬細(xì)胞數(shù)量和吞噬活性。與對(duì)照組比較，復(fù)方白毛夏枯草各劑量組小鼠血清中IgG含量明顯升高（P0.05或P0.01)，而IgM含量無(wú)明顯差異（P0.05），提示該方主要對(duì)IgG介導(dǎo)的特異性體液免疫功能具有促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方白毛夏枯草各劑量組能明顯促進(jìn)PHA刺激的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力（P0.01或P0.05或P0.001)，但各組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與對(duì)照相比無(wú)明顯差異（見(jiàn)表1）,這提示，該方對(duì)淋巴細(xì)胞免疫功能的促進(jìn)作用主要是針對(duì)免疫原活化后的淋巴細(xì)胞。表5  復(fù)方白毛夏枯草對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力的影響（略）免疫功能是機(jī)體防御和清除各種有害因素的重要作用，是體內(nèi)“正氣”的主要體現(xiàn)，包括非特異性免疫功能和特異性免疫功能。本文通過(guò)初步觀察復(fù)方白毛夏枯草對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力等非特異性免疫指標(biāo)和血清IgG/IgM 含量、脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力等特異性免疫指標(biāo)，以期探索該方的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。結(jié)果顯示，該方對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠上述部分免疫功能具有不同程度的促進(jìn)作用，其中對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的促進(jìn)作用呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，提示該方治療上呼吸