多糖含量測定的幾種不同方法比較

1、多糖含量測定的幾種不同方法比較系別：一專業(yè)：.學號:姓名:指導教師:指導教師職稱：一生物工程多糖含量測定的幾種不同方法比較摘要：本文綜述了多糖含量測定的幾種常用方法，主要有苯酚-硫酸法、3,5-二硝基水楊酸法（簡稱DNS法）、意酮-硫酸法、色譜法、紅外光譜定量分析多糖法等。并對這些方法的優(yōu)缺點進行了分析和比較。這些方法可為多糖含量測定提供一定的參考，并為多糖含量測定的更深入研究提供一定的理論基礎。關鍵詞：多糖；含量；測定；方法AreviewofdifferentmethodsAreviewofdifferentmethodstothedeterminationofpolysaccharides

2、tothedeterminationofpolysaccharidesAbstract:Abstract:Paperreviewedsomedifferentmethodstothedeterminationofpolysaccharides,initphenol-vitriolmethod,3,5-twonitrosalicylicacid(DNS)method,anthrone-vitriolmethod,chromatography,infraredspectrumquantitativeanalysisandetchadbeendealedwith.Andtheadvantagesan

3、ddisadvantagesofthesemethodsareanalyzedandcompared.Itprovidedsomerelatedinformationandbasedtheoriestothedeterminationofpolysaccharidescontent.KeywordsKeywords：polysaccharides;content;determination;methods中文摘要I英文摘要II1前言12化學法測定多糖含量1.2.1苯酚-硫酸法1.2.2 3,5-二硝基水楊酸法(簡稱DNS法)22.3慈酮-硫酸法2.3色譜法測定多糖含量的研究3.1氣相色譜法(G

4、C).3.1液相色譜法(HPLC)3.1薄層色譜法(TLC)4.4其他方法4.紅外光譜定量分析多糖法4.生物傳感器法5.5結論5.6展望6.參考文獻6.致謝9.1 1前言多糖(polysaccharidesPS)是由10個以上的單糖聚合而成的生物高分子1。多糖包含均多糖(homosaccharide)F雜多糖(heterosaccharide)前者是由同一種單糖組成，后者則是由兩種以上不同的單糖組成。多糖除含有單糖外，還含有糖醛酸、氨基糖、糖醇、脫氧糖等基團。多糖按來源可分為動物多糖、植物多糖、微生物多糖和藻類多糖；按酸堿性可分為酸性多糖、中性多糖及堿性多糖；按溶解性可分水溶性多糖、水不溶性多

5、糖、酸性多糖和堿性多糖等2。多糖的研究是現(xiàn)代藥學研究的熱點之一，多糖具有多種功效，經(jīng)研究表明其在免疫調節(jié)、抗月中瘤、抗炎、抗?jié)儭⒔档湍懝檀?、降血壓以及抗血栓等多方面具有良好的藥理活性。在多糖工業(yè)生產(chǎn)過程中，常需對多糖的含量進行測量和監(jiān)控，由于多糖的種類繁多，多糖含量和存在形式也多變。因此，選擇適當?shù)亩嗵欠治龇椒ㄊ种匾?。傳統(tǒng)的多糖含量測定方法為苯酚-硫酸法和慈酮-硫酸法，但這兩種方法測定步驟繁瑣，而且只能測定樣品中總糖的含量，若樣品中含有單糖，則會使測定結果偏高；再者硫酸具有嚴重的腐蝕性，苯酚極易氧化，給實驗操作帶來極大不便。3,5-二硝基水楊酸法(簡稱DNS法)具有操作簡便、快速、靈敏度高

6、、雜質干擾較小等優(yōu)點，近年來逐漸被應用于植物藥、中成藥、海洋生物藥等藥物中多糖含量的測定3-5。本文綜述了多糖測定的幾種常用方法，并對其優(yōu)缺點進行了比較。這些方法可為多糖含量測定提供一定的參考，并為多糖的更深入研究提供部分理論基礎。2 2化學法測定多糖含量苯酚-硫酸法在多糖的定量分析中，苯酚-濃硫酸法是被廣泛應用的方法之一6。其原理是多糖在濃硫酸作用下水解成單糖并迅速脫水生成糠醛衍生物，與苯酚縮合成有色化合物，以葡萄糖為標準品，然后用紫外分光光度計在約490nm處測定光吸收值與糖濃度的線性關系，進而對樣品定量，所得的測定結果是以葡萄糖含量計的多糖含量。該方法具有操作簡單、快速、重復性好，顯色后

7、穩(wěn)定性較好等優(yōu)點，但對有色樣品結果易偏高。苯酚-硫酸比色法主要用于甲基化的糖、戊糖、寡糖類以及多聚糖的測定。甚至可以用于糖肽和糖蛋白的測定7-8。此法優(yōu)勢在于可以進行大量樣品的測定，實驗時基本不受蛋白質存在的影響，且產(chǎn)生的有色化合物在120min內顏色穩(wěn)定。從目前各種文獻資料來看，苯酚硫酸法測定的最大吸收波長多在480-491nm范圍內，而實際應用時會因為水解出單糖種類的不同而出現(xiàn)偏差，如螺旋藻多糖中含有鼠李糖、半乳糖、甘露糖、核糖等成分，最大吸收波長在480nm處；茯苓多糖水解后得木糖、核糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖，最大吸收波長于490nm處9。楊春等指出苯酚暴露于空氣中或在日光下

8、被氧化逐漸變成粉紅色，故應進行沙浴回流，用棕色瓶子收集儲出液。得到純凈苯酚。實驗用苯酚溶液（未加硫酸）為現(xiàn)配溶液，并且每次用苯酚濃度一致，否則將會影響實驗結果。苯酚液配制時，需按比例加入一定量的鋁片和碳酸氫鈉蒸儲，所得儲分再加蒸儲水配得10。3,53,5-二硝基水楊酸法（簡稱 DNSDNS 法）3,5-二硝基水楊酸法（簡稱DNS法）是一種新的多糖含量測定的方法，此法已被用于植物藥、中成藥、海洋生物藥等藥物中多糖成分的含量測定11。DNS法測多糖含量具有操作簡便、快速、靈敏度高雜質干擾較小等優(yōu)點。DNS法測定原理為3,5-二硝基水楊酸與多糖水解產(chǎn)物還原糖共熱后生成棕紅色的氨基化合物（3-氨基-5

9、-硝基水楊酸），在一定的范圍內，還原糖的含量和反應液顏色成比例關系，利用比色法可測定多糖的含量。DNS比色法中，色素等還原性物質可與DNS顯色劑顯色，采用水解前測定值校正水解后測定值的方法，簡便、有效地排除了色素等雜質的干擾12-15。DNS試劑即3,5-二硝基水楊酸試劑，可采用直接配制的方法，也可先配制甲液和乙液，再將兩液混合。配制顯色劑過程中加入結晶酚可增加試劑的顯色作用，亞硫酸鈉可進一步增強試劑的穩(wěn)定性。在選擇測定波長時要考慮多方面的因素，既要考慮是否為最大吸收波長，又要考慮在該波長下測定結果是否穩(wěn)定。樣品測試液的制備過程中，酸水解時間不能太短也不能太長，時間短則多糖水解不完全，時間長則

10、單糖和鹽酸發(fā)生化學反應生成糖醛，不能和3,5-二硝基水楊酸發(fā)生縮合反應。因此，水解時間要嚴格控制，否則會影響測定結果的準確性。該方法為半微量定糖法，簡便、快速、適用于大量樣品的測定。 改良的DNS方法可使己糖和戊糖的混合糖樣的分析結果更準確160止匕外，尹銀嘉等采用DNS法測二味康口服液中多糖的含量，二味康口服液具有益氣扶正，補脾益腎等功效，主要成分為黃黃和刺五加170制劑工藝主要保留了多糖成分。用該法測定多糖含量可以克服用苯酚-硫酸法測定過程中硫酸帶來的腐蝕性，因此安全可靠。2.32.3 慈酮-硫酸法意酮-硫酸法是多糖類在濃硫酸作用下水解、脫水，再與慈酮結合成有色化合物，于最大吸收波長處測吸

11、光度18-200慈酮-硫酸法穩(wěn)定性較差，宜新鮮配制并注意避光。止匕外，色氨酸含量較高的蛋白質對顯色反應有一定的干擾。意酮-硫酸法測多糖含量，特點是幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊糖與己糖，而且可以測所有寡糖類和多糖類，其中包括淀粉、纖維素等。在沒有必要細致劃分各種碳水化合物的情況下，用意酮法可以一次測出總量，省去許多麻煩，因此，有特殊的應用價值。同時，苯酚有毒性，為致癌物質，且對某些多糖可能誘導發(fā)生副反應，致使測得結果不準，使用意酮則避開了此點不足。此外，不同的糖類與慈酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺，故測定糖的混合物時，常因不同糖

12、類的比例不同造成誤差。意酮-硫酸法測定時的最大吸收波長差異范圍較大，一般葡萄糖在580nm處有最大吸收峰，而從目前文獻來看，植物多糖最大吸收波長多在562-630nm范圍內21。在測定過程中，待測液需在冰水浴中緩慢滴加慈酮-硫酸液，經(jīng)過一定時間，在沸水浴中反應后，冰浴降溫后測量。另外，慈酮-硫酸溶液的加入量要與供試品溶液成一定比例才有較好的顯色效果，加熱時間要足夠。3 3色譜法測定多糖含量的研究氣相色譜法(GC)(GC)氣相色譜法可定性、定量分析多糖的組分和含量。一般是將多糖酸水解或甲醇醇解，用衍生物法以增加其揮發(fā)性。在GC研究中，糖有兩類衍生物，一類是三甲基硅醴衍生物，是通過糖在叱噬或二甲基

13、亞碉等非水溶劑中與六甲基二硅烷，三甲基氯硅烷，雙三甲基硅烷基乙酰胺，三氟甲磺酸三甲基硅酯等反應形成，這類衍生物容易制取并具有較強揮發(fā)性。另一類糖衍生物是醋酸衍生物，包括三氟醋酸鹽多羥基醇衍生物，三氟醋酸多羥基醇衍生物，醋酸乙醛歷衍生物，醋酸月青衍生物等。氣相色譜分析法常用的色譜柱有填充柱和毛細管色譜柱22-240近年來，隨著多程序升溫技術的完善，石英毛細管柱應用更為普遍，在糖分析中主要采用AT-1701、DB-1701、HP-1701、OV-1701、OV-17、OV-225、SE-30、SE-33、SE-52、DB-1等。被分離產(chǎn)物的檢測常采用靈敏度高、選擇性好的檢測器，最常用的氫火焰離子化

14、檢測器(hydrogenflameionizationdetector;FID),具有最高的選擇性和靈敏度。此外也用到火焰光度檢測器(flamephotomericdetectogFPD)、電子捕獲檢測器(electroncapturdetectorECD)、質譜檢測器(MS)等。液相色譜法(HPLC)(HPLC)糖的高效液相色譜分析方法已成為常規(guī)分析方法?？蓪翁呛凸烟沁M行常量和微量分析。高效液相色譜分析糖類化合物色譜柱一般采用氨基鍵合固定相，可用于分離一般的單糖、寡糖等。常用的氨基鍵合色譜柱有碳水化合物柱、Amino-sil-X-1、Lichroeorb-NH2、HypersilNH2、P

15、olygosil60-5NH2、YMG-NH2、Amide-80、ZORBAX氨基柱等。乙月青和水通常可作為流動相，糖的保留時間隨水的比例減少而減少。C18和C8硅烷色譜柱也常用于糖分析。此外，陽離子交換柱也可用于糖分析，一般是以聚苯乙烯型陽交換色譜樹脂制作，有H+型、Ca2+、Ag+、Pb2+等離子型。一般以水作流動相，在較高溫度(75-85C)下，分離效果較好。HPLC常用 的 檢 測 器 有 示 差 折 光 檢 測 器(differentialrefractometers,RI)、 蒸 發(fā) 光 檢 測 器(evaporativelightscatteringdetector,ELSD)、

16、紫外檢測器(ultravioletdetector,UV)、熒光檢測器(fluorescencedetector,FLD)、電化學檢測器(electrochemicaldetector;ED)等。RI檢測器具有樣品毋需衍生化、操作簡單、穩(wěn)定性高等優(yōu)點，但存在靈敏度偏低、不適合梯度洗脫、受流速和溫度影響大等缺點；ELSD是一種質量檢測器，其靈敏度比RI檢測器高；UV檢測器主要用于在190-210nm有紫外吸收的非衍生醛糖、酮糖、二糖和脫氧糖等，二級管陣列檢測器(photodiodearraydetector;PDA)是紫外-可見光檢測器中的一種，二者靈敏度遠高于RI和ELSD檢測器；FLD是利用

17、物質的熒光吸收而實現(xiàn)檢測，靈敏度更高。由于糖類不具有紫外吸收和熒光吸收，需對其進行衍生化處理。檢測極限可達到pmol-amol級，可比RI檢測器靈敏度提高1000倍。常用的糖類紫外衍生化試劑有2,4-二硝基苯、對甲氧基苯胺、2-氨基叱噬、6-氨基唾咻、苯甲酸、對氨基苯甲酸乙酷、3-甲基-1-苯基-2叱唾琳酮、苯甲酰氯等。另外糖醇可以對硝基苯甲酰氯(p-nitrobenzoylchloride)衍生后可在260nm檢測，肌醇在以異氟酸苯酯(phenylisocyanate衍生后在240nm處可檢測25。作為熒光檢測的4J生化試劑主要2-氨基叱噬、方甲基羥基肌、鄰氨基苯甲酸、2-氨基苯甲酰胺、2,

18、3-二氨基蔡、1-苯基-3-甲基-5-叱口坐咻酮、乙酰乙酰苯胺、3-(4-竣基苯甲酰基)-2-唾咻竣基醛、8-氨基蔡-1,3,6-三磺酸、1-氨基在-3,6,8-三磺酸、7-氨基-蔡磺酸、四甲基若丹明等26o薄層色譜法(TLC)(TLC)薄層色譜又叫薄層層析，是根據(jù)樣品組分與吸附劑的吸附力及其在展層溶劑中的分配系數(shù)的不同而使混合物分離。薄層層析對設備要求不高，分離效果好、操作簡便、分離速度快(1-3h)、樣品需要量較少(500ng-1g)紙色譜因分離時間和樣品量均處劣勢，逐漸淘汰。鄧國棟等以雙波長薄層掃描技術測定了一種茶葉多糖的單糖組成。建立了單糖濃度和斑點面積的定量關系，以此對樣品中各單糖作

19、定量分析，并對阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖檢測限可達1.2仙名TLC方法還可以實現(xiàn)糖醇、寡糖等分析，檢測限都可達到Ng級別。利用高效薄層色譜(highper-formancethinlayerchromatographHPTLC),進行薄層掃描，檢測限可達到ng級27o4 4其他方法紅外光譜定量分析多糖法紅外光譜定量分析多糖是通過對特征吸收譜帶強度的測量來求出組份含量。其理論依據(jù)是朗伯-比耳定律28。定量分析方法可用標準曲線法、求解聯(lián)立方程法方法進行定量分析。利用傅里葉變換紅外光譜估測多糖含量時，一般認為糖量的特征波在970cm和1182cm之間。Blakeney等用近紅外反射光譜測定了谷物

20、中非淀粉多糖， 該方法快速、 便宜，作為一種快速分析具有營養(yǎng)功能重要多糖的方法使用具有很大的潛力。生物傳感器法生物傳感器法利用酶的專一性反應，能實現(xiàn)糖的快速分析。葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖等糖類的快速分析生物傳感器已較成熟，檢測限達3.5X0-5mol/L29o5 5結論通過以上介紹的對多糖含量測定的幾種不同方法比較，不難發(fā)現(xiàn)每種方法都有自己的優(yōu)缺點，現(xiàn)在就對這幾種方法針對不同植物多糖含量的測定進行一下比較。傳統(tǒng)的多糖含量測定方法為苯酚-硫酸法和慈酮-硫酸法，但這兩種方法測定步驟繁瑣，而且只能測定樣品中總糖的含量，若樣品中含有單糖，則會使測定結果偏高；再者硫酸具有嚴重的腐蝕性，苯酚極易氧化，給實

21、驗操作帶來極大不便。3,5-二硝基水楊酸法（簡稱DNS法）具有操作簡便、快速、靈敏度高、雜質干擾較小等優(yōu)點，近年來逐漸被應用于植物藥、中成藥、海洋生物藥等藥物中多糖含量的測定30。DNS法測定原理為3,5-二硝基水楊酸與多糖水解產(chǎn)物還原糖共熱后生成棕紅色的氨基化合物（3-氨基-5-硝基水楊酸），在一定的范圍內，還原糖的含量和反應液顏色成比例關系，利用比色法可測定多糖的含量。DNS比色法中，色素等還原性物質可與DNS顯色劑顯色，采用水解前測定值校正水解后測定值的方法，簡便、有效地排除了色素等雜質的干擾。DNS試劑即3,5-二硝基水楊酸試劑，可采用直接配制的方法，也可先配制甲液和乙液，再將兩液混合

22、。配制顯色劑過程中加入結晶酚可增加試劑的顯色作用亞硫酸鈉可進一步增強試劑的穩(wěn)定性。在選擇測定波長時要考慮多方面的因素，既要考慮是否為最大吸收波長，又要考慮在該波長下測定結果是否穩(wěn)定。樣品測試液的制備過程中，酸水解時間不能太短也不能太長，時間短則多糖水解不完全，時間長則單糖和鹽酸發(fā)生化學反應生成糖醛，不能和3,5-二硝基水楊酸發(fā)生縮合反應。因此，水解時間要嚴格控制，否則會影響測定結果的準確性。DNS法可用于竣甲基殼聚糖的含量測定，鄒巧根等用該法測得了竣甲基殼聚糖的含量，竣甲基殼聚糖為殼聚糖的竣甲基化產(chǎn)物310 殼聚糖是從蝦、蟹類等甲殼類海洋生物中提取出的甲殼素經(jīng)脫乙?；玫?，竣甲基殼聚糖由于引入

23、竣甲基使其水溶容性大大增強，在制藥、生物醫(yī)用材料行業(yè)用途廣泛。由于組成竣甲基殼聚糖的單糖結構為竣甲基氨基葡萄糖和竣甲基乙酰氨基葡萄糖而且均為還原糖， 從原理上分析很適合用DNS法測定其含量，最終測定結果與理論相符。蘇廣宇等人在研究產(chǎn)幾丁質酶海洋細菌的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化實驗中，也采用了DNS法測定多糖含量。 幾丁質廣泛存在于甲殼綱動物蝦蟹及昆蟲的甲殼中， 具有抗癌活性，免疫調節(jié)等作用。由于幾丁質很穩(wěn)定，在測定其含量前必須先進行降解，其中酶解法反應條件溫和，不必加入其他反應試劑，不發(fā)生其他副反應，產(chǎn)物聚合度適中、節(jié)能、高效、無污染，所以常用酶解法先進行酵解再進行含量測定，其測定方法與用DNS法測

24、其他多糖方法類似。DNS法越來越多的被用于多糖的含量測定，越來越受工作者的關注。采用DNS法可以克服傳統(tǒng)方法的不足，而且測定結果準確度高，精密度良好，安全可靠，操作簡單，原理清晰明了，容易掌握，因此，DNS法具有很好的應用前景。6 6展望多糖的研究雖然較生命科學中其他三大類物質蛋白質、核酸和脂類起步為晚，但由于其在生命過程中重要的生理功能及其廣泛的應用被不斷挖掘，引起了人們越來越大的興趣?，F(xiàn)在多糖已成為天然藥物及保健品研發(fā)中的重要組成部分。同時也應看到，無論是國內還是國外，多糖的研究與蛋白質和核酸的研究相比還有相當?shù)牟罹?。所以開展各種植物多糖分離純化及含量測定方法研究，既有理論意義，也有現(xiàn)實意

25、義。止匕外，糖分析還有其他一些方法，隨著檢測儀器不斷革新升級，多糖含量檢測方法趨于多樣化。多糖含量檢測總的發(fā)展趨勢是使檢測過程更簡便、快速、準確、實現(xiàn)痕量檢測、在線檢測及更多反應結構信息等。參考文獻1李衛(wèi)彬，陽文輝，黃鎖義，等.當歸總糖、還原糖和多糖的含量測定方法探討J.微量元素與健康研究，2008,25(3):46-47.2王俊，朱一凡.柳寄生多糖的提取分離和含量測定J.中國中藥雜志，2007,32(22):2387-2390.3王紅英，錢斯日古楞，趙前程，等.3,5-二硝基水楊酸比色法測定麥冬多糖含量J.沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，2005,36(5):628-630.4崔本連，宋海韜，齊放，等.3

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