西安地區(qū)青少年骨密度值及其與維生素D受體基因多態(tài)性的研究

1、西安地區(qū)青少年骨密度值及其與維生素D受體基因多態(tài)性的研究         11-01-10 15:23:00     編輯：studa20【摘要】  目的 提供西安地區(qū)9-12歲青少年腰椎骨密度(BMD)的正常參考值，研究維生素D受體基因(VDR)多態(tài)性與9-12歲青少年BMD的關(guān)系。方法 收集排除影響骨代謝疾病的西安地區(qū)9-12歲漢族兒童200例，進行問卷調(diào)查、體格測量；用雙能X線骨密度儀(DEXA)測量腰椎BMD；用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性方法(PCRR

2、FLPs)，分析VDR基因的2個限制性酶切位點Bsm、Fok的多態(tài)性分布。結(jié)果 各組青少年腰椎BMD值均隨年齡增長而逐漸增高，且與年齡呈顯著正相關(guān)(P<0.001)。9-10歲男、女性之間BMD無明顯差異(P>0.05)，11歲以后女性BMD高于男性(P<0.05)；各組青少年身高(P<0.001，r=0.418-0.582)、體重(P<0.05，r=0.627-0.816)與BMD均呈明顯正相關(guān)；ff基因型BMD低于Ff與FF基因型，分別為(0.631±0.064)g/cm2、(0.654±0.012)g/cm2和(0.689±0.

3、058)g/cm2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.24，P<0.05)。結(jié)論 VDR基因在Fok酶切位點的多態(tài)性與9-12歲漢族青少年BMD相關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  骨密度；基因多態(tài)性；維生素D受體；青少年ABSTRACT: Objective  To observe the bone mineral density (BMD) of Han 9-12 children aged from 9 to 12 years old in Xian, and the relation between vitamin D receptor gene polymorphism and b

4、one mineral density. Methods  Totally 200 cases of 9-12 yearold Han children without bone metabolism diseases were randomly selected. Questionnaire investigation and physical measurement of height and weight were made. BMD was measured by dual energy X ray absorptiometry. VDR gene polymorphism

5、(cleavaged by restriction endonuclease of Bsm and Fok) was analyzed by PCRRFLP. Results  BMD in lumbus was increased with age for both genders, and a positive correlation between bone mass and age was observed (P<0.001). There was no significant difference in BMD of children between females

6、and males under 11 years old, but females had a higher BMD than males between the ages of 11 and 12 years (P<0.05); BMD in lumbus was significantly correlated with height (P<0.001, r=0.418-0.582) and weight (P<0.05, r=0.627-0.816); BMD of the ff genotype (0.631±0.064) was lower than th

7、at of genotype Ff (0.654±0.012) and genotype FF (0.689±0.058) with a significant difference (P<0.001). Conclusion  The VDR gene polymorphism in the site cleavaged by restriction endonuclease of Fok is related to BMD of Han children aged 9-12 years.KEY WORDS: bone mineral density; g

8、ene polymorphism; vitamin D receptor; children骨密度(bone mineral density, BMD)是決定骨強度的主要因素之一，能夠預(yù)測骨折的發(fā)生率。它受年齡、性別、遺傳、營養(yǎng)狀況、雌激素水平等的影響，其中遺傳因素是BMD的主要影響因素。確認(rèn)影響B(tài)MD的遺傳因素，對于闡明骨質(zhì)疏松癥病理生理機制以及早期預(yù)測骨質(zhì)疏松發(fā)病的危險因素具有重要意義。本研究檢測了我國西安地區(qū)9-12歲漢族青少年BMD以及維生素D受體基因(vitamin D receptor, VDR)Bsm、Fok 2個等位基因型的分布頻率，探討VDR基因多態(tài)性與9-12歲漢族青少年B

9、MD的關(guān)系。1  對象和方法1.1  對象  隨機抽取2003年7月至2005年7月在我院門診就診的9-12歲青少年200名(男100名，女100名)，詢問疾病史和家族史，并進行體格檢查排除影響骨代謝疾病。其中滿9周歲不滿10周歲歸為9歲年齡組(男25名，女25名)，滿10周歲不滿11周歲歸為10歲年齡組(男25名，女25名)，以此類推。為了排除雌激素對BMD的影響，故要求女性研究對象為尚未有月經(jīng)初潮者。1.2  方法1.2.1  問卷調(diào)查  主要內(nèi)容包括年齡、性別、民族、有否骨折病史和長期服用影響骨代謝的藥物等。由專人按照方案設(shè)計要

10、求，詢問家長。1.2.2  身高、體重的測量  使用專用身高體重測量儀，按文獻1的要求測量。1.2.3  BMD的測定  采用美國Hologic公司生產(chǎn)的HologicQDR 2000型雙能量X線骨密度儀(DEXA Dual Energy Xray Absorptiometry)。為保證機器掃描的質(zhì)量，應(yīng)用HologicQDR 2000型自動內(nèi)部質(zhì)量保證和控制系統(tǒng)進行工作，精密度為0.4%。由專職測量員測量第2-4腰椎正位骨密度，準(zhǔn)確定位后，開始掃描，由微機自動分析并打印結(jié)果。1.2.4  VDR等位基因的測定  取1mL新鮮靜脈血，

11、用申博公司提供的基因組DNA抽提試劑盒抽提外周血白細(xì)胞中DNA。設(shè)計特異性的引物2對2，見表1。    分別按照下列條件進行PCR反應(yīng)：基因組DNA 200ng、dNTP 200mol/L、MgCl2 1.5mmol/L、引物0.5mol/L、Taq plus(Taq+Pfu)DNA聚合酶2.5u和1×Taq plusDNA聚合酶緩沖液，加水至終體積50L；PCR反應(yīng)條件為95預(yù)變性5min，95變性40s，分別68、58、60退火40s，72延伸40s，30個循環(huán)，最后72延伸7min。同時設(shè)陰性對照。分別用限制性內(nèi)切酶Bsm、Fok進行酶切。Bsm酶

12、切產(chǎn)物用20g/L的瓊脂糖膠電泳，F(xiàn)ok酶切產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳。于ZFA2型紫外透射分析儀下觀察酶切結(jié)果。表1  VDR多態(tài)性分析所用引物（略）Table 1  Primers of VDR gene polymorphism1.2.5  統(tǒng)計方法  用SPSS 10.0 for Windows軟件，采用多協(xié)變量方差分析和t檢驗。檢驗水準(zhǔn)=0.05(雙側(cè))。2  結(jié)果2.1  9-12歲青少年的身高、體重和腰椎BMD的測量結(jié)果  見表2。200例青少年腰椎BMD值均隨年齡增長而逐漸增高，且與年齡呈顯著正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r

13、分別為：男性0.80、女性0.70，P<0.001)。9-10歲男女性之間BMD無明顯差異(P>0.05)，11歲以后女性BMD高于男性(P<0.05)。9-12歲男、女性青少年身高與BMD均呈明顯正相關(guān)(P<0.001，r=0.418-0.582)，各年齡組男女性體重與BMD始終呈顯著性正相關(guān)(P<0.05，r=0.627-0.816)。     11-01-10 15:23:00     編輯：studa20表2  9-12歲青少年的身高、體重和腰椎BMD的測量結(jié)果（略）

14、Table 2  The height, weight and BMD in lumbus of children aged from 9 to 12 years old2.2  PCR結(jié)果和酶切結(jié)果  以基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增，VDR基因產(chǎn)物為265bp和800bp。用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性方法(PCRRFLPs)法確定VDR基因Fok酶切位點多態(tài)性為：Ff基因型(終產(chǎn)物為有265bp、169bp、96bp三條帶)，ff基因型(終產(chǎn)物為有169bp、96bp二條帶)，F(xiàn)F基因型(終產(chǎn)物為有265bp一條帶)。VDR基因Bsm酶切位點多態(tài)性為：

15、bb基因型(終產(chǎn)物為有650bp、150bp二條帶)，BB基因型(終產(chǎn)物為800bp一條帶)，Bb基因型(終產(chǎn)物為有650bp、150bp、800bp三條帶)(圖1)。圖1  酶切結(jié)果圖示（略）Fig.1 Genotypes of VDR SCP by PCRRFLPA: Bsm, 1: Bb(800, 650, 150bp); 2: bb(650, 150bp); 3: BB(800bp); M: marker; B: Fok, 1: Ff(265, 196, 69bp); 2: ff(196, 69bp); 3: FF(265bp); M: marker2.3  VDR

16、基因型以及與BMD的關(guān)系  VDR基因Fok酶切位點等位基因型與BMD相關(guān)，F(xiàn)F型118例(59%)，F(xiàn)f型60例(30%)，ff型22例(11%)。3組基因型BMD的平均值為FF型：(0.689±0.058)g/cm2，F(xiàn)f型：(0.654±0.012)g/cm2，ff型：(0.631±0.064)g/cm2。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Fok酶切位點等位基因VDR三種基因型之間的BMD的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.24，P<0.05)。VDR基因Bsm酶切位點等位基因型與BMD無關(guān)，Bb型170例(85%)，bb型12例(6%)，BB型18例(9%)。3組基

17、因型BMD的平均值為Bb型：(0.675±0.028)g/cm2，bb型:(0.664±0.069)g/cm2，BB型：(0.671±0.017)g/cm2。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在Bsm酶切位點，不同等位基因型的BMD無差異(F=1.73, P>0.05)。3  討論    骨量峰值(peak bone mass, PBM)代表個體一生中所能達(dá)到的最大BMD值或骨礦含量值(bone mineral content, BMC)，骨量峰值的高低與原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥發(fā)生密切相關(guān)。目前研究表明，提高兒童、青少年時期所積累的骨量使PB

18、M達(dá)到最高可有效預(yù)防原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生3。本研究采用雙能X線骨密度儀(DEXA)測量西安地區(qū)9-12歲青少年腰椎骨密度，建立西安地區(qū)9-12歲青少年骨礦含量的正常參考值：9-12歲女性骨礦含量分別為(0.593±0.035)、(0.632±0.041)、(0.687±0.029)和(0.748±0.062)g/cm2；男性骨礦含量分別為(0.616±0.027)、(0.640±0.018)、(0.651±0.003)和(0.707±0.020)g/cm2。各組青少年腰椎BMD值均隨年齡增長而逐漸增高，且與年齡、

19、身高、體重呈正相關(guān)。9-10歲男、女性之間BMD無明顯差異，11歲以后女性BMD高于男性。    既往研究提示4女性BMD增長的關(guān)鍵時期在14歲以前，至14歲時其全身總的BMD值已達(dá)成人平均BMD值的90%。男性BMD增長的關(guān)鍵時期在16歲以前，至16歲時其全身總的BMD值約為成人平均BMD值的95%。在BMD增長的過程中出現(xiàn)兩次BMD增長突增期，且女性加速時間較早，即女性BMD突增期為11歲和14歲，男性BMD突增期為12歲時和15歲。該觀點在本研究中得到進一步證實，女性11歲以后骨礦含量高于男性。因此，在青少年時期，特別是突增期前后，應(yīng)增加鈣的攝入，保證將來能

20、有較高的骨峰值。同時，本研究還顯示身高、體重與腰椎BMD呈明顯正相關(guān)，與有關(guān)文獻報道一致5，在青少年時期，男女應(yīng)維持一定的、合適的體重，以獲得較高的骨峰值。    本研究發(fā)現(xiàn)VDR基因Fok酶切位點多態(tài)性與BMD相關(guān)，與國外研究結(jié)果相似6。VDR基因多態(tài)性影響B(tài)MD的機制尚不清楚。Gross等7研究發(fā)現(xiàn)由于F型VDR基因5端的ATG突變?yōu)锳CG，當(dāng)f型VDR基因從第一位起始密碼子ATG開始轉(zhuǎn)錄時，F(xiàn)型VDR基因卻從下游6個核苷酸后存在ATG起始密碼子開始轉(zhuǎn)錄。因此，F(xiàn)位點的VDR蛋白質(zhì)較f位點短3個氨基酸長度，故與配體親和力、mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)運的活力較f位點高

21、，從而增加腸道對鈣的吸收而增加BMD，具體機制有待進一步深入研究。    通過本研究為西安地區(qū)9-12歲青少年骨礦含量提供了正常參考值，并初步探討VDR基因Bsm、Fok酶切位點多態(tài)性與青少年BMD的關(guān)系。其他VDR基因酶切位點多態(tài)性與青少年BMD的關(guān)系及其相關(guān)機制有待進一步研究?！緟⒖嘉墨I】  1劉忠厚，楊定焯，朱漢民，等. 中國人原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn) J. 中國骨質(zhì)疏松雜志, 1999, 5(1):13.2Gross C, Eccleshall TR, Malley PJ, et al. The presence of a polymorphis

22、m at the translation initiation site of vitamin D receptor gene is associated with low bone mineral density in postmenopausal MexicanAmerican women J. J Bone Miner Res, 1996, 11:18501855.3Lawrence GR. Maintaining the lifelong vitality and integrity of skeletal tissue J. Bone, 2007, 40(5):14.4劉加昌，歐陽巧

23、洪，張 瑾，等. 身高、體重對青少年骨密度的影響 J. 中國臨床康復(fù), 2002, 6(21):32263228.5Xu H, Chen JX, Zhang TM, et al. Correlation between hand and total body bone density in normal Chinese children J. Bone, 2007, 41(3):360365.6Ames SK, F11is KJ, Gunn SK, et al. Vitamin D receptor gene FokI polymorphism predicts calcium absorpt

24、ion and bone mineral density in children J. J Bone Miner Res, 1999, 14(5):740746.7Gross C, Krishnan AV, Malloy PJ, et al. The vitamin D receptor gene start codon polymorphism: A functional analysis of FokI variants J. J Bone Miner Res, 1998, 13(11):16911699.     11-01-10 15:23:00

25、     編輯：studa20表2  9-12歲青少年的身高、體重和腰椎BMD的測量結(jié)果（略）Table 2  The height, weight and BMD in lumbus of children aged from 9 to 12 years old2.2  PCR結(jié)果和酶切結(jié)果  以基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增，VDR基因產(chǎn)物為265bp和800bp。用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性方法(PCRRFLPs)法確定VDR基因Fok酶切位點多態(tài)性為：Ff基因型(終產(chǎn)物為有265bp、169bp、9

26、6bp三條帶)，ff基因型(終產(chǎn)物為有169bp、96bp二條帶)，F(xiàn)F基因型(終產(chǎn)物為有265bp一條帶)。VDR基因Bsm酶切位點多態(tài)性為：bb基因型(終產(chǎn)物為有650bp、150bp二條帶)，BB基因型(終產(chǎn)物為800bp一條帶)，Bb基因型(終產(chǎn)物為有650bp、150bp、800bp三條帶)(圖1)。圖1  酶切結(jié)果圖示（略）Fig.1 Genotypes of VDR SCP by PCRRFLPA: Bsm, 1: Bb(800, 650, 150bp); 2: bb(650, 150bp); 3: BB(800bp); M: marker; B: Fok, 1: Ff

27、(265, 196, 69bp); 2: ff(196, 69bp); 3: FF(265bp); M: marker2.3  VDR基因型以及與BMD的關(guān)系  VDR基因Fok酶切位點等位基因型與BMD相關(guān)，F(xiàn)F型118例(59%)，F(xiàn)f型60例(30%)，ff型22例(11%)。3組基因型BMD的平均值為FF型：(0.689±0.058)g/cm2，F(xiàn)f型：(0.654±0.012)g/cm2，ff型：(0.631±0.064)g/cm2。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Fok酶切位點等位基因VDR三種基因型之間的BMD的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.24，P

28、<0.05)。VDR基因Bsm酶切位點等位基因型與BMD無關(guān)，Bb型170例(85%)，bb型12例(6%)，BB型18例(9%)。3組基因型BMD的平均值為Bb型：(0.675±0.028)g/cm2，bb型:(0.664±0.069)g/cm2，BB型：(0.671±0.017)g/cm2。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在Bsm酶切位點，不同等位基因型的BMD無差異(F=1.73, P>0.05)。3  討論    骨量峰值(peak bone mass, PBM)代表個體一生中所能達(dá)到的最大BMD值或骨礦含量值(bone

29、 mineral content, BMC)，骨量峰值的高低與原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥發(fā)生密切相關(guān)。目前研究表明，提高兒童、青少年時期所積累的骨量使PBM達(dá)到最高可有效預(yù)防原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生3。本研究采用雙能X線骨密度儀(DEXA)測量西安地區(qū)9-12歲青少年腰椎骨密度，建立西安地區(qū)9-12歲青少年骨礦含量的正常參考值：9-12歲女性骨礦含量分別為(0.593±0.035)、(0.632±0.041)、(0.687±0.029)和(0.748±0.062)g/cm2；男性骨礦含量分別為(0.616±0.027)、(0.640±0.018)

30、、(0.651±0.003)和(0.707±0.020)g/cm2。各組青少年腰椎BMD值均隨年齡增長而逐漸增高，且與年齡、身高、體重呈正相關(guān)。9-10歲男、女性之間BMD無明顯差異，11歲以后女性BMD高于男性。    既往研究提示4女性BMD增長的關(guān)鍵時期在14歲以前，至14歲時其全身總的BMD值已達(dá)成人平均BMD值的90%。男性BMD增長的關(guān)鍵時期在16歲以前，至16歲時其全身總的BMD值約為成人平均BMD值的95%。在BMD增長的過程中出現(xiàn)兩次BMD增長突增期，且女性加速時間較早，即女性BMD突增期為11歲和14歲，男性BMD突增期為1

31、2歲時和15歲。該觀點在本研究中得到進一步證實，女性11歲以后骨礦含量高于男性。因此，在青少年時期，特別是突增期前后，應(yīng)增加鈣的攝入，保證將來能有較高的骨峰值。同時，本研究還顯示身高、體重與腰椎BMD呈明顯正相關(guān)，與有關(guān)文獻報道一致5，在青少年時期，男女應(yīng)維持一定的、合適的體重，以獲得較高的骨峰值。    本研究發(fā)現(xiàn)VDR基因Fok酶切位點多態(tài)性與BMD相關(guān)，與國外研究結(jié)果相似6。VDR基因多態(tài)性影響B(tài)MD的機制尚不清楚。Gross等7研究發(fā)現(xiàn)由于F型VDR基因5端的ATG突變?yōu)锳CG，當(dāng)f型VDR基因從第一位起始密碼子ATG開始轉(zhuǎn)錄時，F(xiàn)型VDR基因卻從下游6個核苷酸后存在ATG起始密碼子開始轉(zhuǎn)錄。因此，F(xiàn)位點的VDR蛋白質(zhì)較f位點短3個氨基酸長度，故與配體親和力、mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)運的活力較f位點高，從而增加腸道對鈣的吸收而增加BMD，具體機制有待進一步深入研究。    通過本研究為西安地區(qū)9-12歲青少年骨礦含量提供了正常參考值，并初步探討VDR基因Bsm、Fok酶切位點多