血管內(nèi)皮生長因子、微血管密度與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系

1、    血管內(nèi)皮生長因子、微血管密度與乳腺癌 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系        【摘要】目的探討血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、微血管密度（MVD）與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系。方法應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）與免疫組織化學(xué)SP法，檢測92例乳腺癌、12例癌旁組織V組織VEGF表達(dá)、MVD以及21例乳腺癌、12例癌旁組織VEGF mRNA的表達(dá)。結(jié)果乳腺癌組織，VEGF121（1.16%±0.1%）和VEGF165(1.01%±0

2、.1%)表達(dá)高于癌旁組織(0.96%±0.14%)、(0.88%±0.1%)，P<0.050.01。此外，MVD與VEGF表達(dá)具有顯著的正相關(guān)關(guān)系（r=0.702,P<0.01）。VEGF表達(dá)和MVD與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)關(guān)系密切（P<0.050.01）。VEGF高表達(dá)組和高M(jìn)VD組的無復(fù)發(fā)存活時間低于VEGF低表達(dá)組和低MVD組,差異具有非常顯著性（P<0.01）。結(jié)論VEGF與乳腺癌血管生成密切相關(guān)；VEGF和MVD表達(dá)的增高對乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)有促進(jìn)作用；VEGF和MVD對乳腺癌患者的無復(fù)發(fā)存活時間能起到預(yù)測作用?！娟P(guān)鍵詞】乳腺腫

3、瘤；內(nèi)皮生長因子；新生血管化，病理性；預(yù)后The relationship between vascular endothelial growth factor , microvascular density, lymph node metastasis and prognosis of breast carcinomaWANG Fulin(Email:w-fl), WEI Lixin, CHEN Lezhen. Department of Pathology, General Hospital of PLA. Beijing 100853, China【Abstract】ObjectiveT

4、o investigate the relationship between vascular endothelial growth factor (VEGF) microvascular density (MVD), lymph node metastasis and prognosis of breast carcinoma (BC). MethodsVEGF protein expression and MVD in 92 cases of BC and VEGF mRNA expression in part of the cases were studied by immunohis

5、tochemistry methods and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) technique. ResultsVEGF mRNA expression in BC tumor tissues were higher than those in adjacent normal tissues. Increment of both VEGF121 and VEGF165 showed significant difference (P<0.050.01). In addition, VEGF145 exp

6、ression was also observed in BC. There was a close positive correlation between VEGF and MVD (r=0.702, P<0.01). VEGF protein expression and MVD correlated significantly with lymph node metastasis and tumor relapse (P<0.050.01). The time period of relapse-free-survival (RFS) in the patient grou

7、p with high VEGF expression and MVD was significantly lower than RFS in the group with low VEGF expression and MVD (P<0.01). ConclusionVEGF is highly related to angiogenesis of BC. The increase of VEGF and MVD may promote lymph node metastasis and relapse of BC. VEGF and MVD may have prognostic v

8、alue in RFS of BC patients.【Key words】Breast neoplasms；Endothelial growth factors；Neovascularization, pathologic；Prognoses腫瘤的生長與擴散取決于血管生成1。腫瘤細(xì)胞能夠分泌眾多的血管生成因子，其中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是最為重要的血管生成因子之一，VEGF通過增加微血管通透性，刺激血管內(nèi)皮增殖，而促進(jìn)腫瘤的微血管生成。我們采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和免疫組織化學(xué)SP技術(shù)檢測乳腺癌組織VEGF蛋白、VEGF mRNA的表達(dá)以及微血管密度（MVD），探討其與

9、乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系。材料與方法1.收集我院19871991年間手術(shù)切除的乳腺癌腫瘤組織石蠟包埋標(biāo)本92例?；颊呔鶠榕裕挲g2978歲。每例標(biāo)本做4 m厚的切片。92例腫瘤組織學(xué)類型為浸潤性導(dǎo)管癌。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者52例。隨訪時間682個月，中位隨訪時間39個月，有36例腫瘤復(fù)發(fā)。腫瘤復(fù)發(fā)率：指乳腺癌根治術(shù)后，在隨訪期內(nèi)腫瘤局部復(fù)發(fā)的病例數(shù)與總觀察例數(shù)的比值。2.免疫組織化學(xué)方法：采用SP法，腫瘤組織切片進(jìn)行微波抗原修復(fù)，多克隆抗-VEGF抗體（A20，Santa Cruz公司產(chǎn)品）和單克隆抗-CD34抗體（Zymed 公司產(chǎn)品）分別標(biāo)記，DAB顯色，以PBS緩沖液代替第一抗體作陰性

10、對照。3陽性判定標(biāo)準(zhǔn)及定量測定：（1）VEGF和CD34分別以腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。（2）在低倍視野下選取腫瘤微血管數(shù)量最豐富的區(qū)域，在200×視野范圍計算3個視野的微血管數(shù)目，取平均值作為MVD列入分析。（3）對VEGF標(biāo)記的切片選取陽性細(xì)胞密集區(qū)域，在高倍顯微鏡（400×）下選取100個陽性細(xì)胞（約35個視野），應(yīng)用彩色象病理分析系統(tǒng)（微視-MVH-98型），測定平均吸光度（A，曾稱光密度OD）值，以此代表陽性胞質(zhì)單位面積內(nèi)VEGF相對含量。4.RT-PCR：（1）選取新鮮乳腺癌組織21例及癌旁組織12例，采用異硫氫酸胍一步法提取組

11、織總RNA，進(jìn)行RT-PCR。擴增產(chǎn)物經(jīng)摻有溴乙錠的瓊脂糖凝膠電泳；紫外線檢測并經(jīng)凝膠象分析系統(tǒng)（英國UV公司）處理，以各條帶的密度-面積乘積作為其定量。（2）VEGF擴增引物核苷酸序列2：上游引物：5-CGAAGTGGTGAAGTTCATGGATG-3；下游引物：5-TTCTGTATCAGTCTTTCCTGGTGAG-3。 內(nèi)參照基因三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物核苷酸序列3：上游引物：5-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3；下游引物：5-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3。2對引物由中國科學(xué)院微生物所合成。主要試劑包括：總RNA提取劑（Trizol）和逆轉(zhuǎn)錄酶（M0-

12、MLV）,Gibco 公司產(chǎn)品，Tag酶、dNTP和六聚寡核苷酸隨機引物（購自華美生物技術(shù)有限公司）。5.統(tǒng)計學(xué)處理：VEGF蛋白、MVD在病理因素中的定量統(tǒng)計采用方差分析，VEGF mRNA在癌和癌旁組織中表達(dá)的差異檢驗應(yīng)用成組t檢驗，VEGF與MVD之間的關(guān)系運用等級相關(guān)檢驗，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存分析采用時序檢驗。結(jié)果1.VEGF mRNA表達(dá)：（1） PCR產(chǎn)物定性觀察：在21例乳腺癌和12例癌旁組織中，VEGF mRNAs表達(dá)的PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果見1。乳腺癌和癌旁組織主要有5條帶，其中VEGF引物特異性帶分別為403 bp（VEGF121）、475 bp（V

13、EGF145）、535 bp（VEGF165）和607 bp（VEGF189）。GAPDH引物帶195 bp。（2）PCR產(chǎn)物的定量觀察：分別以VEGF mRNA的PCR產(chǎn)物各條帶定量與GAPDH的PCR產(chǎn)物條帶定量的比值，作為各VEGF mRNA在組織中的相對含量。乳腺癌組織中VEGF mRNA表達(dá)高于癌旁組織，分別為：21.2%（VEGF121）、8.8%（VEGF145）、15.6% （VEGF165）、11.7%（VEGF189），其中VEGF121、VEGF165在癌和癌旁組織中的表達(dá)有顯著意義（P<0.050.01），見表1。2VEGF蛋白表達(dá)、MVD及二者之間的關(guān)系：VEG

14、F陽性顆粒定位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，部分癌旁上皮及血管內(nèi)皮細(xì)胞陽性表達(dá)。VEGF陽性的腫瘤細(xì)胞分布呈異質(zhì)性，著色程度較強的主要位于腫瘤細(xì)胞浸潤區(qū)域。VEGF平均A值范圍為0.1060.194（0.154±0.019），中位數(shù)0.153。腫瘤組織切片中血管內(nèi)皮細(xì)胞染色程度均勻一致，微血管分布呈異質(zhì)性，微血管密集區(qū)多位于腫瘤細(xì)胞浸潤的前緣部位（2，3）。微血管計數(shù)范圍為11186（92.1±47.9），中位數(shù)87。VEGF與MVD的關(guān)系經(jīng)等級相關(guān)檢驗證實，呈顯著正相關(guān)（r=0.702，P<0.01），即MVD值隨著VEGF表達(dá)程度的增加而增高，VEGF A值越大，MVD值就

15、越高。M：DNA分子量標(biāo)記物，T：腫瘤組織，N：癌旁組織1乳腺癌腫瘤及癌旁組織VEGF mRNAPCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果表121例乳腺癌組織與12例癌旁組織VEGF mRNA相對含量的比較VEGF mRNAs分型GAPDH比值(±s)腫瘤組織癌旁組織VEGF1211.16±0.140.96±0.14*VEGF1450.79±0.120.72±0.12VEGF1651.01±0.100.88±0.09VEGF1890.88±0.090.78±0.07注：與腫瘤組織組比較：*P<0.01，P<0.0

16、5 3VEGF蛋白表達(dá)、MVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的VEGF均高于無淋2乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，VEGF染色，腫瘤細(xì)胞呈陽性表達(dá)SP法×1003同上例，CD34染色，微血管分布于腫瘤細(xì)胞巢周圍SP法×100巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有顯著性意義（P<0.05，P<0.01）。同樣，腫瘤復(fù)發(fā)組與無復(fù)發(fā)組相比，前者VEGF、MVD高于后者（P<0.05，P<0.01），見表2。表292例乳腺癌VEGF表達(dá)、MVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系觀察指標(biāo)例數(shù)(±s)VEGFMVD淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有520.159±0.019107.1

17、77;49.9*無400.148±0.01874.2±38.6腫瘤復(fù)發(fā)有360.158±0.019101.3±47.5*無560.147±0.02078.7±39.3注：與無轉(zhuǎn)移和無復(fù)發(fā)組比較，*P<0.01，P<0.05 4VEGF蛋白、MVD表達(dá)與腫瘤預(yù)后的關(guān)系：分別以VEGF A中位數(shù)和MVD中位數(shù)為分界點，將患者分為VEGF高表達(dá)組與VEGF低表達(dá)組、高M(jìn)VD組與低MVD組。在VEGF高表達(dá)組和VEGF低表達(dá)組中，復(fù)發(fā)率為52.2%（24/46）、26.1%（12/46）；在高M(jìn)VD組和低MVD組中，復(fù)發(fā)率為58.

18、7%（27/46）、19.6%（9/46）。VEGF高表達(dá)組和高M(jìn)VD組的復(fù)發(fā)率高于VEGF低表達(dá)組和低MVD組（P<0.050.01）。單變量分析顯示，VEGF高表達(dá)組和高M(jìn)VD組的無復(fù)發(fā)存活時間低于VEGF低表達(dá)組和低MVD組（P<0.01）。討論VEGF是一種相對分子質(zhì)量40 00045 000的分泌性糖蛋白。VEGF前體RNA包含8個外顯子和7個內(nèi)含子。對VEGF基因分子序列研究顯示，VEGF蛋白8個外顯子組成的單一基因轉(zhuǎn)錄后經(jīng)剪切表達(dá)5種不同相對分子質(zhì)量的VEGF mRNA，根據(jù)氨基酸長短依次命名為VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF145及VEGF1

19、21。VEGF165、VEGF121 (可溶性)擴散力強，容易到達(dá)靶細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，二者與VEGF的生物學(xué)活性密切相關(guān)。用RT-PCR方法觀察VEGF mRNA在乳腺癌組織中的表達(dá)狀況，并對其表達(dá)作相對定量檢測，結(jié)果顯示，乳腺癌組織中VEGF mRNA表達(dá)亞型有VEGF189、VEGF165、VEGF145及VEGF121，并且腫瘤組織比癌旁組織VEGF mRNA表達(dá)量增高，VEGF121和VEGF165兩個低分子量亞型表達(dá)量最高，與文獻(xiàn)報道4相符。此外，MVD的高低與VEGF蛋白表達(dá)水平密切相關(guān)（r=0.702,P<0.01），在腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)

20、較強的區(qū)域，MVD增高，表明VEGF是誘導(dǎo)腫瘤血管發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子，在腫瘤的血管生成中起著關(guān)鍵作用。在乳腺癌組織中還觀察到VEGF145表達(dá)。目前對VEGF145報道很少，主要在女性生殖系統(tǒng)腫瘤的細(xì)胞株、子宮內(nèi)膜、胎盤組織和羊胎膜組織中檢測到少量的VEGF145表達(dá)。其表達(dá)常需第二輪PCR擴增才能觀察到5。其在乳腺癌組織中表達(dá)的意義需進(jìn)一步探討。腫瘤新生血管是腫瘤細(xì)胞侵襲的首要靶目標(biāo)，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及其在轉(zhuǎn)移部位的生長依賴于腫瘤血管生成。目前認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有兩條途徑：（1）腫瘤血管生成促使腫瘤體積增加，腫瘤邊緣部位的腫瘤細(xì)胞與淋巴管的接觸增多，或者通過靜脈-淋巴管吻合處從血液進(jìn)入淋

21、巴管，并且，腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率隨著血液循環(huán)中腫瘤細(xì)胞的增加而增高，因此，腫瘤血管生成對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有間接的促進(jìn)作用6；（2）從腫瘤微血管密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的結(jié)論中推測，由于對內(nèi)皮細(xì)胞免疫標(biāo)記的抗體不能區(qū)分淋巴管與血管，在腫瘤新生血管中肯定包含新生的淋巴管成分，雖然對血管生成因子作用于淋巴管的機制尚不明確，但是，血管生成因子可能對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞同樣具有促分裂和增殖作用，誘導(dǎo)“淋巴管生成”7。因此，腫瘤血管生成與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能具有直接關(guān)系，它更有利于腫瘤細(xì)胞浸潤淋巴管，促進(jìn)腫瘤向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在VEGF蛋白高表達(dá)和高M(jìn)VD組中，腫瘤復(fù)發(fā)率和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較低表達(dá)組明顯增高。因此，可以根據(jù)二者的表達(dá)

22、水平，并與其他腫瘤標(biāo)記物或形態(tài)學(xué)指標(biāo)相結(jié)合，為篩選需要輔助性治療的病例，并為以腫瘤內(nèi)微血管為靶點的抗腫瘤血管生成的治療提供客觀依據(jù)。作者單位：王輔林（100853 韋立新（100853 參考文獻(xiàn)1Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med, 1971,285:1182-1186.2Tischer E, Mitchell R, Hartman T, et al. The human gene for vascular endothelial growth factor. Mutiple protein forms are encoded through alternative exon splicing. J Biol Chem, 1991,266:11947-11954.3Tokunaga K, Nakamura Y, Sakata K, et al. Enhanced expression of a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene in human lung cancers.