高效液相色譜法測(cè)定心達(dá)康片的含量

1、高效液相色譜法測(cè)定心達(dá)康片的含量    【摘要】  目的應(yīng)用反相高效液相色譜法測(cè)定心達(dá)康的含量。方法以甲醇-0.2磷酸（4555）（pH2.27）為流動(dòng)相，采用C18化學(xué)鍵合硅膠為固定相，在檢測(cè)波長(zhǎng)368nm下進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果槲皮素、山奈素、異鼠李素三種黃酮分別在7.88g.ml-139.39g?ml-1、1.64g?ml-18.18g?ml-1、23.40g?ml-1117.0g?ml-1范圍內(nèi)線性良好，日內(nèi)RSD1.38（n3），日間RSD1.96（n3），回收率99.4100.5（n3）。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、可靠、準(zhǔn)確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

2、 【關(guān)鍵詞】  心達(dá)康片；總黃酮；高效液相色譜；含量測(cè)定    Abstract:Objective To determination the content of total flavanoids in Xindakang tabalets by RP-HPLC.Methods The contents of quercetin,kaempferol and isofhamnetin were determined by HPLC simultaneously.C18 column（250×4.6mm,5m）was used with the

3、 mixture of CH3OH-0.2% phosphate (4555)（pH2.27）as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL?min-1 with the detection wavelength at 368 nm.Results The calibration curves showed their good linearities in the range of 7.88 g?ml-139.39g?ml-1、1.64g?ml-18.18g?ml-1、23.40g?ml-1117.0g?ml-1 respectively,the w

4、ithin-day RSD and between-day RSD were less than 1.38（n3）and 1.96（n3）respectively;the recovery of total flavanoids was 99.4100.5（n3）.Conclusion The method appeared to be simple,reliable and accurate,and it can be used for the quality control of Xindakang tablets.    Key words:Xindakan

5、g tablets；total flavanoids；RP-HPLC；determination    心達(dá)康片主要成分為沙棘總黃酮，具有補(bǔ)益心氣、化瘀通脈的功效,對(duì)缺血性心臟病、心肌缺血、心血瘀阻型冠心病等療效顯著1。原標(biāo)準(zhǔn)采用比色法2,只能測(cè)定其中總黃酮的含量。呂元琦等3采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定出了沙棘藥物制品心達(dá)康片中山奈酚和槲皮素兩種成分，而本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定心達(dá)康片中槲皮素、山奈素、異鼠李素三個(gè)組分,效果好,準(zhǔn)確可靠。    1儀器和試藥    LC-6A液相色譜儀（島津）；SPD-10A

6、紫外檢測(cè)器（島津）;LC-2002色譜工作站；Branson-200超聲清洗儀；GL-88B漩渦混合器（海門麒麟醫(yī)用儀器廠）；日本A&D電子分析天平。    心達(dá)康對(duì)照品：槲皮素、山奈素和異鼠李素（中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用）；心達(dá)康片樣品（四川雅達(dá)藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)：050501、050502、050503，總黃酮標(biāo)示量為5mg/片）。    甲醇（色譜純）；水為重蒸水；其他試劑均為分析純。    2方法和結(jié)果    2.1對(duì)照品溶液的制備

7、0;   分別取心達(dá)康對(duì)照品（槲皮素、山奈素、異屬李素）適量，用甲醇配成含槲皮素19.69g?ml-1、山奈素4.90g?ml-1、異屬李素70.14g?ml-1的溶液，即得。    2.2供試品溶液的制備    取本品10片精密稱定，研細(xì)。精密稱取適量（約相當(dāng)于心達(dá)康5mg），置50ml量瓶中，加甲醇溶解，超聲30min，并稀釋、定容至刻度，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。    2.3色譜條件    十八烷基硅烷鍵合硅膠柱：（150×4.6）m

8、m，5m；流動(dòng)相：甲醇-0.2磷酸（4555），pH:2.27；檢測(cè)波長(zhǎng)為368nm；進(jìn)樣量：10l。理論塔板數(shù)按槲皮素、山奈素和異鼠李素峰計(jì)算分別大于4 00046。    2.4流動(dòng)相的選擇    試驗(yàn)了甲醇-水、乙腈-0.02 mol?L-1磷酸溶液、甲醇-0.02 mol?L-1磷酸溶液等不同流動(dòng)相體系下心達(dá)康片中各組分的分離情況，結(jié)果以后者為佳；改變?cè)擉w系中甲醇的比例，結(jié)果當(dāng)甲醇-0.02 mol?L-1磷酸（4555）（pH2.27）時(shí)，三組分分離最好，色譜峰達(dá)到較高的對(duì)稱性，獲得理想的理論踏板數(shù)。由此確定本試驗(yàn)色譜分離流

9、動(dòng)相為甲醇-0.02 mol?L-1磷酸（45：55）（pH2.27）。    2.5檢測(cè)波長(zhǎng)的確定    按2.1、2.2項(xiàng)下配制對(duì)照品溶液和供試品溶液，照分光光度法在200400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，繪制紫外吸收光譜圖，結(jié)果在368nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故確定368nm為本品測(cè)定波長(zhǎng)。    2.6陰性空白試驗(yàn)    按照心達(dá)康片處方量，稱取空白輔料適量至50ml容量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾。取濾液作為供試品溶液，按含量測(cè)定的色譜條件進(jìn)行HPLC檢查。結(jié)果表明

10、，空白輔料不出峰，不會(huì)干擾心達(dá)康含量的測(cè)定色譜圖見圖1C。    2.7色譜分離結(jié)果    在上述色譜條件下，按槲皮素、山奈素和異鼠李素峰計(jì)算分別大于4 000條件下，山奈素與異鼠李素峰完全分離，分離度大于1.5。對(duì)照品槲皮素、山奈素和異鼠李素的保留時(shí)間分別為12.03min,21.13min,24.13min，樣品中槲皮素、山奈素和異鼠李素的保留時(shí)間分別為12.04min,21.46min,24.53min，見圖1A、B。    2.8標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備    按本品含量測(cè)定項(xiàng)

11、下方法配制系列濃度對(duì)照品溶液，分別精密吸取槲皮素、山奈素和異屬李素對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各0.4ml、0.8ml、0.9ml、1.0ml、1.2ml、1.5ml、2.0ml于10ml容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得一系列不同濃度對(duì)照品溶液，均以10l進(jìn)樣，測(cè)得峰面積積分值，濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，槲皮素在7.88g?ml-139.39g?ml-1范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為：A=26 583C+19 092,r=0.999 2；山奈素在1.64g?ml-18.18g?ml-1范圍內(nèi)線性良好, 回歸方程為：A=40 454C5 679.2,r=0.999 0；異鼠李

12、素在23.40g?ml-1117.0g?ml-1范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為：A=29 542C108 332,r=0.999 2。    用標(biāo)準(zhǔn)曲線低溶液不斷稀釋進(jìn)樣，測(cè)得本品槲皮素、山奈素和異鼠李素最低檢出濃度分別為CQ=0.787 7g?ml-1，CK=0.652 8g?ml-1，CI=0.504 0g?ml-1即測(cè)得本品槲皮素、山奈素和異鼠李素最低檢出量分別為7.87ng、6.53ng、5.04ng，最低檢測(cè)限圖見圖1D。    2.9進(jìn)樣精密度試驗(yàn)    取本品10片(批號(hào)：050501)，研細(xì)，

13、分別稱取細(xì)粉約150mg、200mg和250mg三份，各置于50ml容量瓶中，用甲醇溶解，超聲30min，稀釋定容至刻度，過濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣。照上述色譜條件，10l連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定3次。記錄相應(yīng)峰面積，計(jì)算進(jìn)樣精密度結(jié)果。槲皮素、山奈素和異鼠李素進(jìn)樣精密度分別0.63、0.30和0.56，滿足含量測(cè)定要求。    2.10重現(xiàn)性試驗(yàn)    照本品含量測(cè)定項(xiàng)下方法配制供試品溶液(批號(hào)：050501) 低、中、高濃度共3份，在五個(gè)不同日期，照本品含量測(cè)定項(xiàng)下方法，測(cè)定同一批供試品(批號(hào)：050501)含量，槲皮素、山奈素和異鼠李素精密度分別為

14、：低濃度1.05；1.96；0.51，總黃酮4.97mg；。中濃度0.40；0.00；0.30，總黃酮4.96mg。高濃度1.18；0.00；0.63，總黃酮4.95mg。說明樣品溶液配制好后五天內(nèi)測(cè)定，結(jié)果穩(wěn)定。    2.11重復(fù)性試驗(yàn)    照本品含量測(cè)定項(xiàng)下方法配制供試品溶液(批號(hào)：050501) 低、中、高濃度各3份，同實(shí)驗(yàn)條件下精密吸取供試品溶液10l，注入液相色譜儀在368nm波長(zhǎng)處分離檢測(cè)，記錄各濃度對(duì)應(yīng)色譜峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算各標(biāo)示量，槲皮素、山奈素和異鼠李素精密度分別為：低濃度0.52；0.00%；0.31%，總黃

15、酮5.00mg。中濃度0.52；0.00%；0.42%，總黃酮4.97mg。高濃度1.02；0.00；1.38，總黃酮4.98mg。    2.12加樣回收率試驗(yàn)    取已知標(biāo)示量含量（99.50%）的本品(批號(hào)：050501)10片，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于心達(dá)康5mg），置50ml量瓶中，加甲醇溶解，超聲30min，并稀釋、定容至刻度，濾過，取續(xù)濾液作為樣品溶液。分別取上述樣品溶液5.0 ml 9份于9只10 ml離心管中，分為三組，分別加入低（含Q18.10g?ml-1、K3.98g?ml-1、I62.90g?ml-1

16、）、中（含Q22.60g?ml-1、K4.91g?ml-1、I79.60g?ml-1）、高（含Q26.90g?ml-1、K5.84g?ml-1、I94.70g?ml-1）濃度對(duì)照液5ml各三份，混勻，即為回收率考察低、中、高濃度供試品溶液。照本品含量測(cè)定的高效液相色譜條件，在368nm波長(zhǎng)處分離檢測(cè)，記錄各濃度對(duì)應(yīng)色譜峰面積，計(jì)算各組溶液總黃酮的含量，進(jìn)而計(jì)算出回收量，按公式計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。表1回收率測(cè)定結(jié)果    2.13樣品的測(cè)定    2.13.1對(duì)照品溶液的制備分別取心達(dá)康對(duì)照品（槲皮素、山奈素、異屬李素）適量，用甲醇

17、配成含槲皮素19.69g?ml-1、山奈素4.90g?ml-1、異屬李素70.14g?ml-1的溶液，即得。    2.13.2供試品溶液的制備取本品10片，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于心達(dá)康5mg），置50ml量瓶中，加甲醇溶解，超聲30min，并稀釋、定容至刻度，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。    2.13.3測(cè)定方法精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10l，分別注入液相色譜儀，以外標(biāo)法計(jì)算，即得。結(jié)果見表2。 表2心達(dá)康片含量測(cè)定結(jié)果本次試驗(yàn)了甲醇-水、乙腈0.02mol?L-1磷酸溶液、甲醇0.02mol?L-1磷酸溶液等

18、不同流動(dòng)相體系下心達(dá)康片中各組分的分離情況，結(jié)果流動(dòng)相甲醇0.02mol?L-1磷酸（4555）（pH2.27）時(shí)能有效分離心達(dá)康片劑中三組分，同時(shí)具有條件簡(jiǎn)單、平衡時(shí)間短等特點(diǎn)。加0.2的磷酸使溶液pH為2.27可減少色譜峰的拖尾，使色譜峰達(dá)到較高的對(duì)稱性，獲得理想的理論塔板數(shù)。由此確定本試驗(yàn)色譜分離流動(dòng)相為甲醇0.02mol?L-1磷酸（4555）（pH2.27）。    現(xiàn)有的心達(dá)康片的部頒標(biāo)準(zhǔn)是以異鼠李素為對(duì)照品，1三氯化鋁的無水乙醇為顯色劑，采用分光光度法測(cè)定沙棘總黃酮含量。文中采用RPHPLC法測(cè)定心達(dá)康片中槲皮素、山奈素、異鼠李素等黃酮含量，不僅可準(zhǔn)確測(cè)定片中沙棘總黃酮的含量，且可有效地控制各黃酮苷元的含量比例，為完善和提高心達(dá)康片的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1鄭