非何杰金淋巴瘤微血管密度及其血清bFGF水平

1、非何杰金淋巴瘤微血管密度及其血清bFGF水平    【關(guān)鍵詞】  堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子Tissue microvessel density and levels of serum basic fibroblast growth factor in patients with nonHodgkins lymphoma【Abstract】 AIM:  To explore the levels of serum basic fibroblast growth factor (bFGF) and the tissue microvesse

2、l density (MVD) in nonHodgkins lymphoma (NHL) patients with different clinical and pathological features. METHODS:  In 32 NHL patients (13 newly diagnosed and 19 in remission after chemotherapy) and 10 healthy controls, ELISA was used to detect their serum level of bFGF and F RAG was used as th

3、e marker of endothelial cells to detect MVD in 20 cases of the 32 NHL patients and 10 cases of benign lymphadenopathy. The statistic t test was used to analyze the difference among different groups. RESULTS:  The mean concentrations of serum bFGF in the untreated patients and patients in remiss

4、ion after chemotherapy were（7.6±1.2) ngL-1 and （4.1±1.0）ngL-1, respectively, which were higher than that （1.7±1.4）pgL-1 in healthy controls (P<0.05). The serum bFGF level in Tcell type NHL was significantly higher than that in Bcell type (10.7±1.4) ngL-1 vs （2.7±1.0）ngL-1

5、, P<0.05. The mean MVD of the 20 NHL cases (39±18) was obviously higher than that in benign lymphadenopathy group (13±5, P<0.05) and the mean MVD in Tcell type NHL was significantly higher than that in Bcell type（47±15 vs 27±17, P<0.05）. CONCLUSION:  The NHL patient

6、s, especially those with Tcell type NHL, have significantly higher serum bFGF levels and tissue MVD than controls. The data presented here strongly suggest that the bFGFmediated angiogenesis may closely be correlated with the pathogenesis and pathologic characteristics in NHL.【Keywords】 basic fibrob

7、last growth factor; nonHodgkins lymphoma; ELISA; microvessel density; immunohistochemistry【摘要】 目的:  分析不同臨床特征和病理分型的非何杰金淋巴瘤(NHL)患者的血清堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)水平及瘤性組織微血管密度（MVD）的差異. 方法: 收集32（初發(fā)未經(jīng)化療13，化療后緩解19）例NHL患者及10例健康對(duì)照者血清，采用夾心ELISA法測(cè)定其bFGF水平；采用vWF抗體組化染色法檢測(cè)其中20（T細(xì)胞型8，B細(xì)胞12）例NHL組織的MVD，以10例良性淋巴結(jié)病組織作為對(duì)照. 統(tǒng)

8、計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)法. 結(jié)果: 13例初發(fā)患者（7.6±1.2）ngL-1、19例化療后緩解患者(4.1±1.0) ngL-1的bFGF水平均顯著高于健康對(duì)照 (1.7±1.4) pgL-1，P<0.05；初治患者與緩解患者間bFGF水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但T細(xì)胞型（10.7±1.4）ngL-1顯著高于B細(xì)胞型（2.7±1.0）ngL-1, P<0.05. 20例NHL及10例良性淋巴結(jié)病組織平均MVD分別為(39±18)和(13±5)，相差顯著（P<0.05）；T細(xì)胞型患者平均MVD明顯高于B細(xì)胞型（47&

9、#177;15 vs 27±17, P<0.05）. 結(jié)論: NHL，尤其是T細(xì)胞型患者，其血清bFGF水平及組織MVD均值顯著增高. 提示bFGF介導(dǎo)的血管新生可能與NHL的發(fā)生及病理特征密切相關(guān).【關(guān)鍵詞】 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；非霍奇金淋巴瘤；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；微血管密度；免疫組化0引言在腫瘤形成過(guò)程中，異常的血管生成發(fā)揮著關(guān)鍵作用1. 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是一種十分重要的正性調(diào)控因子. 已發(fā)現(xiàn)，在多種癌癥患者的體液中，bFGF水平明顯高于正常人2. 最近，Salven等3研究指出，初發(fā)非何杰

10、金淋巴瘤(NHL)患者血清中高濃度的bFGF可用于預(yù)后判斷，提示bFGF可能是該病一種新的病情指標(biāo)，值得進(jìn)一步探討. 據(jù)此，我們測(cè)定了32例NHL患者血清bFGF水平；并檢測(cè)了部分NHL組織的微血管密度（microvessel density，MVD），以進(jìn)一步證實(shí)血清bFGF水平和MVD與NHL惡性生物學(xué)特征間的關(guān)系.1對(duì)象和方法1.1對(duì)象西京醫(yī)院血液內(nèi)科200101/200212間NHL患者32（男17，女15）例，年齡3082（平均54）歲，均經(jīng)組織病理確診. 按病理形態(tài)學(xué)及免疫組化結(jié)果分為T細(xì)胞型（9例）和B細(xì)胞型(19例),另4例不能分類；按原發(fā)灶不同部位分為結(jié)性（淋巴結(jié)、脾臟及扁桃

11、腺，20例）及結(jié)外（鼻竇鼻腔、胃體、回盲部、腎上腺，12例）兩大類. 采用Ann Arbor法進(jìn)行臨床分期，其中I期5例，II期13例，III期2例，IV期12例. 化療前采血者13例，化療后緩解期采血者19例，化療方案分別為CHOPBleo（環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿、強(qiáng)的松、博萊霉素）和MBACOD（米托蒽醌、博萊霉素、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、地塞米松）. 至2003/02所有患者均存活，并在繼續(xù)觀察中. bFGF對(duì)照血清取自10例健康志愿者；MVD檢測(cè)對(duì)照為10例良性淋巴結(jié)病組織. 20（T細(xì)胞型8，B細(xì)胞型12）例NHL石蠟包埋組織來(lái)自第四軍醫(yī)大學(xué)病理學(xué)教研室.1.2方法1.2.1

12、血清收集及bFGF檢測(cè)采集患者及健康對(duì)照者靜脈血35 mL，室溫靜置1 h,待凝固、血清析出后，2000 g離心10 min, 分離血清，-80凍存?zhèn)錂z. bFGF檢測(cè)采用ELISA法（夾心ELISA檢測(cè)試劑盒系美國(guó)RD System公司產(chǎn)品）. 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品各100 L加入已包被bFGF mAb的96孔板，室溫孵育2 h，洗板后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的bFGF多抗，室溫孵育2 h，再次洗板后加入底物，避光顯色30 min后加入終止液，酶標(biāo)儀上測(cè)各孔A450 nm值. 所有樣本均作復(fù)孔. 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品bFGF濃度及A450 nm值繪制bFGF質(zhì)量濃度-A450 nm標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出每

13、樣本各孔bFGF質(zhì)量濃度，以每樣本兩孔bFGF濃度平均值作為該樣本血清bFGF值.1.2.2微血管密度檢測(cè)采用免疫組化DaKo EnVision二步法切片常規(guī)脫蠟至水；微波修復(fù)10 min，PBS振洗3×5 min；30 mLL-1過(guò)氧化氫甲醇溶液阻斷10 min后，PBS振洗3×5 min；200 mLL-1羊血清封閉，37濕盒內(nèi)孵育60 min，傾去血清，滴加一抗（兔抗人因子相關(guān)抗原  FRAG  DAKO公司），4過(guò)夜，次日復(fù)溫至37；PBS振洗3×5 min后，加DaKo EnVisionTM+/HRP顯色系統(tǒng)（DAKO公司），37孵育

14、60 min；PBS振洗3×5 min后，DAB顯色，水洗終止；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min；脫水透明，中性樹(shù)膠封片. 結(jié)果判定：FRAG（兔抗人因子相關(guān)抗原，DAKO公司）以血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)；MVD計(jì)數(shù)參照Weidner等4報(bào)道的方法，在低倍視野下選取腫瘤微血管數(shù)量（FRAG陽(yáng)性）最豐富區(qū)域，在200×視野范圍計(jì)算5個(gè)視野的微血管數(shù)目，取平均值作為MVD.百事通 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)和非參數(shù)秩和檢驗(yàn).2結(jié)果2.1NHL患者血清bFGF水平32例NHL患者血清bFGF平均濃度為（7.7±1.27）ngL-1，較正常對(duì)照組（1

15、.7±1.4） pgL-1明顯升高（P0.05），雖然緩解期患者血清bFGF較初發(fā)未治者有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 在不同臨床分期與不同發(fā)病部位間血清bFGF水平無(wú)明顯差別，但T細(xì)胞型NHL的bFGF明顯高于B細(xì)胞型. 男女性別及小于和大于60歲的患者血清bFGF無(wú)明顯差別（Tab 1）.表1非何杰金淋巴瘤血清bFGF水平(略)2.2NHL組織MVD20例NHL組織MVD值(39±18)明顯高于對(duì)照組（13±5）（Fig 1，2），其中T細(xì)胞型MVD均值（47±15）明顯高于B細(xì)胞型(27±17) (P0.05)，表明T細(xì)胞型NHL組織有更為豐

16、富的微血管形成.圖1NHL患者組織MVD圖2良性淋巴結(jié)病組織MVD(略)3討論惡性血液病如同實(shí)體瘤也存在異常血管生成現(xiàn)象. 國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)白血病患者的骨髓較健康對(duì)照骨髓有明顯增高的微血管密度，推測(cè)白血病細(xì)胞誘導(dǎo)了異常的骨髓血管生成，這種異常血管生成又是白血病發(fā)生發(fā)展的依賴條件之一，二者互為促進(jìn)5. Vacca等6發(fā)現(xiàn)在NHL組織中，高度惡性組較低度惡性組微血管密度高，提示血管生成與NHL發(fā)生及惡性程度可能有一定關(guān)系.本研究中，多數(shù)NHL患者，包括初發(fā)及化療后持續(xù)緩解者，血清bFGF水平均較正常人有顯著增高,且瘤組織中MVD顯著高于對(duì)照,這一結(jié)果基本支持Vacca的觀點(diǎn). 提示NHL的發(fā)生可能與b

17、FGF誘發(fā)的血管生成有一定相關(guān)性，但血清bFGF水平與NHL原發(fā)部位、年齡及臨床分期并無(wú)直接關(guān)系. 盡管如此，我們發(fā)現(xiàn)NHL患者血清bFGF水平在T細(xì)胞型與B細(xì)胞型之間卻存在明顯差異，T細(xì)胞型MVD均值也明顯高于B細(xì)胞型. 鑒于臨床上T細(xì)胞譜系淋巴瘤往往具有耐藥、易復(fù)發(fā)等高惡性特征，故這一異常的bFGF和MVD是否直接或間接影響了T細(xì)胞型NHL的惡性生物學(xué)過(guò)程，值得進(jìn)一步研究. 至于NHL血清中高水平的bFGF究竟是源自瘤細(xì)胞的自分泌還是機(jī)體對(duì)瘤細(xì)胞反應(yīng)，目前尚無(wú)定論. 因?yàn)轶w內(nèi)分泌bFGF的細(xì)胞較多如外周血白細(xì)胞 7，血管內(nèi)皮細(xì)胞等8. 為試圖說(shuō)明瘤體血清中bFGF升高的機(jī)制，Kandel等

18、9建立了一種鼠纖維肉瘤模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)bFGF的表達(dá)在腫瘤初期處于正常狀態(tài)，至后期鼠血清bFGF則顯著升高，這種變化與瘤體內(nèi)相應(yīng)的血管新生同步. 這一多階段腫瘤血管生成模式雖提示血清bFGF與腫瘤組織血管新生密切相關(guān)，但仍不能說(shuō)明bFGF的確切細(xì)胞來(lái)源. 本結(jié)果在一定程度上也基本支持Kandel的觀點(diǎn).bFGF作為一種強(qiáng)有力的促血管生成劑，在許多腫瘤血管生成中是不可缺少的因素，但并非唯一的因素. 目前發(fā)現(xiàn)，bFGF與VEGF作用密切相關(guān)10，實(shí)驗(yàn)表明靜息期的內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)VEGF，但內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入bFGF或上調(diào)其內(nèi)源性bFGF均能引起靶細(xì)胞的VEGF表達(dá)增加. 動(dòng)物模型顯示，bFGF誘導(dǎo)的V

19、EGF合成及小鼠角膜血管形成，能被VEGF抗體阻斷，因此內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF可能是bFGF誘導(dǎo)血管生成的一種重要的“中介”自分泌因子. 根據(jù)以上文獻(xiàn)報(bào)道并結(jié)合本研究，我們推測(cè)，NHL患者血清中高水平的bFGF也可能是通過(guò)VEGF的中介作用，間接刺激血管新生，致使NHL組織MVD增高，從而影響NHL細(xì)胞的惡性生物學(xué)特性. 因此，這一結(jié)果有可能為以 bFGF/VEGF及其受體為作用靶點(diǎn)的新的抗NHL策略提供初步依據(jù).【參考文獻(xiàn)】1 Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease J. Nat Me

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