感受態(tài)細胞制備及各種感受態(tài)的特點

1、感受態(tài)細胞制備制備感受態(tài)常用得方法就是電擊法與CaC 1 2制備法，以下介紹CaC I 2制備法：1、可以從-80°C冰柜中，取出一支凍存菌株，于事先照過紫外得超凈臺中，用無菌得接種環(huán) 輕輕蘸取菌種后，在無抗平板（由于Roce t ta含有氯霉素抗性,需要涂布在氯彼素抗性得平 板，后而得部就是如此）上劃線，并將菌種迅速放回一80°C保存，在劃線板上做好相應標記，于 37°C培養(yǎng)過夜。2、從37t培養(yǎng)過夜得新鮮平板上挑取一個單克隆,接種于2mlEP管中,3 7°C, 2 20r p m 震蕩培養(yǎng)約6個小時至對數(shù)生長中后期;將該菌懸液以1 : 1 00得比例

2、接種于5 0 ml LB液 體培養(yǎng)基（2瓶）中，37°C振蕩培養(yǎng)2、5小時至O 1）60 0 =0、5.注意：接種比例不得大于1： 10。3、在無菌條件下將細菌轉移到一個無菌、預冷得離心管（50ml）中，在冰上放宜51 Om i n：注意：劃板、接種為了防止意外發(fā)生最好多劃一塊平板與多接一根試管，劃板、接種、轉接 均要嚴格按照無菌操作.4、4°C 50 0 0 g離心5分鐘。用預冷得去禽子水洗滌沉淀，4 °C 5000g離心5分鐘；Note:此步主要就足為了洗去培養(yǎng)基中得鹽等5、沉淀加入2m 1預冷得0、0 5rnol / L Ca Cl2-1 5%甘汕混合溶液，

3、輕吹散，冰浴5分 鐘，4*C 50 0 0g離心5分鐘：6、沉淀加入2m I預冷得0、05mo 1 /L CaCI2-1 5%甘油混合溶液，輕吹散,即成為感受態(tài) 細胞懸液。分裝成5 01 0 0 d得小份，貯存于一70C可保存半年。含15%甘油得0、05mol/L CaCL制備方法：稱取0、28g Ca Cl2（無水，分析純），溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，泄容至100m1 ,高壓滅菌。感受態(tài)細胞得特征感受態(tài)：通過特殊處理使細胞處于能夠吸收外源DNA得狀態(tài)。感受態(tài)細胞得特征：（1）細胞表而集館出一些可接受外來DNA得位點（以溶菌酶處理，可促使受體細胞得接受位 點充分暴露）。（2 ）細

4、胞膜通透性增加（用鈣離子處理,可使膜通透性增加，使DNA直接穿過 質膜進入細胞）。（3）受體細胞得修飾酶活性最髙，而限制酶活性最低，使轉入得DNA分子 不易被切除或破壞.實驗室常用得感受態(tài)細胞1、DH5a菌株克隆菌株：DH5a就是一種常用于質?？寺∨c高拷貝質粒得穩(wěn)左復制得菌株.E、col i DH5a在使用pU C系列質粒載體轉化時，其(p80la cZAM1 5基因產(chǎn)物可與載體編碼得0半 乳糖昔酶氨基端實現(xiàn)a互補，可用于藍白斑篩選鑒別重組菌株。Rec A1與e ndAl得突 變有利于克隆DNA得穩(wěn)左與髙純度質粒DNA得提取?；蛐?F、(p80d I acZAM15 A(lacZYA a r

5、gF)U 16 9. deoR、recA1、e nd A1.h sd R17 (rk-, m k+)、pho A、s u pE4 4、入-、thi1、gy r A 96、r elA 12、TOP1 0菌株a克隆菌株:該菌株適用于高效得DNA克隆與質粒擴增，能保證高拷貝質粒 得穩(wěn)左遺傳。a基因型：f、mcrAA (m rr-hsd RMSm c rBC)、(p8 o、lacZAM1 5s A I acX 7 4> recA1 araA139A (ara-1 eu ) 7697. galU、galK、rps、(S t r r ) endA1、n u pG3、BL21 (DE3 )菌株：蛋白表

6、達菌株：該菌株用于高效表達克隆于含有噬菌體T7啟動子得表達載體(如pET系 列)得基因。該菌株用于T7 RNA聚合酶為表達系統(tǒng)得髙效外源基因得蛋白表達宿主，T7 噬菌體RNA聚合酶基因得表達受控于入 噬菌體DE3區(qū)得acUV5啟動子，該區(qū)整合于 BL21得染色體上。該菌株適合于非毒性蛋白得表達。基因型：F-、ompT、hsdS (r» me )、gal、dem (DE3)4、BL21 (DE3) pLysS菌株蛋白表達菌株:該菌株含有質粒pLysS,因此具有氯徘素 抗性。PLysS含有表達T7溶菌酶得基因，能夠降低目得基因得背景表達水平，但不干擾目得 蛋白得表達。該菌適合表達毒性蛋白

7、與非毒性蛋白?；蛐停篎、ompT、hsdS(rB mtr)、gal、 dem (DE3)、p LysS、Cam r5、R o c e tta感受態(tài)特征：蛋白表達菌株Ros e tta系列菌株來源于BL21系列宿主菌，該系列菌株含有原本在大腸桿菌中稀 少得真核細胞密碼子，增加了真核細胞得蛋白表達水平.(1) R o c et t a (DE 3)該菌株通過一個相容性氯廉素抗性質粒補充大腸桿菌缺乏得6種稀有密碼子(AUA、AGG、 AGA、CUA、CCC、GGA)對應得tRNA,這樣R o c e tta菌株提供了 “萬能”得翻譯, 從而避免因大腸桿菌密碼子使用頻率導致得表達限制，提髙外源基因尤

8、其就是真核基因在原 核系統(tǒng)中得表達水平。t RNA基因由它們得天然啟動子驅動。基因型：F-、ompT、h sdSB (rK mB- )、g a 1、dem、lacY1(DE 3). pRARE (a rgU> argW, i 1 eX, glyTJ e uW,pr o L)(Cmr)補充：晞有密碼子對蛋白茨達紂影響：數(shù)氮基酸都冇一個以上得密碼子，對E. col i密碼子應用惰況分析表明一些密碼子很少使 用尤其就足植奴酸密碼子AGA AGG CGG CGA：異亮奴酸得密碼子AUA；亮奴酸得密碼子CUA與甘奴酸得密碼子 GGA與帰奴酸得密碼子CCC很少菽用到.目得基因中含有過多紂棉有密碼子彼

9、認為就足低表達水平與產(chǎn)生不完全產(chǎn)物那一個 原因。當在氨基端附近出現(xiàn)多個稀冇密碼子須時候.情況更為嚴魚 許參研尤農(nóng)明加禎酸得密碼子AGA與AGG得奇頻出現(xiàn) 吋能大人影響條白得產(chǎn)址。當這些密碼子出現(xiàn)在N端附近時候.這種影響將達到最人。b 多個實臉室報道.在宿主菌 中增加同類I RNA時那些含有稀有密瑪子基因得賞白產(chǎn)姐:將人大捉高。Reset taTMlXf株吋以增加榊氨酸棉有密碼子AGG與 A GA靑亮氨酸魁密碼子A UA；亮氨酸得密碼子CUA與甘氨酸得密碼子GGA與脯奴酸得密碼子CCC，因此,很適合用干茨達那 些含E、coli稀有密碼子基因得目得貴白、(引用自網(wǎng)址(2) Rose t t a2

10、(D E3) p LySs 來源于 Rose t ta(DE3),本菌株含有 pRARE2 質粒, 除了能夠提供原Rosetta(DE3)宿主菌含有AU A, AGG, AGA, CUA, CCC,與GGA六 個稀有密碼子得tRN A外,還提供了第七個稀有密碼子C GG得t R NA。同時,pR A RE 2質粒 具有氯霉素抗性.Rosetta2 (DE 3 )pLyS s載體通過提供稀有密碼子，使得該宿主菌相對于 其她大腸桿菌，能夠提供更加“通用"得蛋白質表達,從而提升目得蛋白表達水平。DE3就是溶 源性得入DE3,所以帶有T7 RNA聚合酶得染色體拷貝。該菌株適用于pET系列載體

11、， 及其她T7啟動子系列載體.含有pLS s質粒，pLySs質粒能夠產(chǎn)生T 7溶菌酶，可以有效降 低目得基因得基礎表達水平。pLySs質粒使得該菌株具有氯每素抗性。pL ySs質粒得起始 復制位點就是P1 5 Origin,這使得該質粒能夠與叫C 一及pBR322衍生得質?；ハ?共存.轉化1、轉化得原理：溶液中得Ca離子與細菌細胞膜結合，在低溫下形成液晶結構，在42°C,90s熱激下，這種液晶結構收縮，將細胞膜扯開孔道，使DNA進入細菌細胞中。2、轉化得步驟：(1)取感受態(tài)細胞置于冰浴中，如需分裝可將剛融化得細胞懸液分裝到無菌預冷得離心管 中，宜于冰浴中.（2）向感受態(tài)細胞中加入目得

12、DNA（50uI感受態(tài)細胞能夠被1ng超螺旋DNA所飽與）, 輕彈混勻,在冰浴中靜置30m i n；注選：一次轉化感受態(tài)細胞得建議用楚為50ul,可以根據(jù)實際情況分裝使用，應注意所冋DNA體積不能趙過感受態(tài)細胞懸液體 枳得f分之也有說法就是不能超過5%。不能加入太多DNA.會影響轉化效率，體積不能超過10U1,所以連接時做Wul 連接體系町用一半做轉化，剩I；得放在49,（3 ）將離心管置于42度水浴中放置90S,然后快速轉移到冰浴中，使細胞冷卻2-3rnin（- 般2m i n）,該過程不要搖動離心管;（4）向每個離心管中加入5 OOUI無菌得LB培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于3 7度搖床 震蕩培養(yǎng)4 5min（150r pm）,目得就是使質粒上相關得抗性標記基因表達,使菌體復蘇。（5）將離心管內容物混勻，可吸取適量（可吸取2 0 0-300UI,也可據(jù)情況而左）轉化產(chǎn)物涂 布平板，而如果預計得克隆較少，可通過離心（4000rpm, 2min ）后，吸掉部分上淸，懸 浮菌體后將其涂布于一個平板