細(xì)菌的黏附及侵襲

1、細(xì)菌的粘附與侵襲細(xì)菌的粘附與侵襲 粘附的定義 粘附是細(xì)菌的粘附素(配體)與宿主細(xì)胞相應(yīng)受體之間的特異性結(jié)合過程，宿主細(xì)胞是否具有相應(yīng)的受體及受體的類型，決定著細(xì)菌能否在特定的部位粘附定植。物理化學(xué)力特異性粘附粘附機制細(xì)菌粘附研究實驗方法粘附細(xì)菌粘附的一般過程 粘附的第一步是非特異性的,借趨化作用使細(xì)菌和易感宿主細(xì)胞表面接近及定位,繼之細(xì)菌菌毛末端的配體(Ligand)與易感宿主細(xì)胞表面處于靜電荷及疏水性結(jié)合; 第二步是特異性的,即在第一步的基礎(chǔ)上,使各菌毛的特殊配體進一步與相應(yīng)特異性受體結(jié)合,如大多數(shù)大腸桿菌的F1只能和上皮細(xì)胞的D甘露糖受體相結(jié)合。非特異性粘附 細(xì)菌的非特異性粘附主要由細(xì)菌與

2、靶細(xì)胞表面的分子疏水性、分子間力(范德華氏力)和靜電引力的大小起主要作用，不依賴于粘附素的存在，其中分子的疏水性尤為重要。細(xì)菌表面疏水性的強弱，是由疏水物質(zhì)的含量決定的。非特異性粘附的特點 細(xì)菌或細(xì)菌某一成分既能吸附于疏水物質(zhì)(如疏水膠、碳?xì)浠衔锏?，又能粘附于上皮細(xì)胞，這種粘附可被外源性非特異性疏水物質(zhì)或親水物質(zhì)所阻斷。特異性粘附 細(xì)菌的特異性粘附是借特異性識別分子(粘附素，配體)和靶細(xì)胞表面的相應(yīng)受體相結(jié)合，在空間構(gòu)型上兩個分子相匹配。特異性的分類 宿主特異性:由于不同種系動物在遺傳學(xué)上的差異，細(xì)胞膜表面成分不盡相同。只有宿主組織內(nèi)有相應(yīng)的受體，細(xì)菌才能在宿主體內(nèi)定居、繁殖。這由同一細(xì)菌

3、表面的抗原性決定。l組織特異性:一種細(xì)菌只能在特定的組織或器官內(nèi)定居。 病原菌病原菌 組織組織淋病奈瑟菌 尿道上皮細(xì)胞腦膜炎奈瑟菌 鼻炎上皮細(xì)胞霍亂弧菌 腸道上皮細(xì)胞百日咳博帶式桿菌 呼吸道上皮細(xì)鼠傷寒沙門氏菌 腸道上皮細(xì)胞幽門螺旋桿菌 胃粘膜釀膿鏈球菌 咽上皮細(xì)胞空腸彎曲菌 腸道上皮細(xì)胞肺炎支原體 呼吸道上皮細(xì)胞 細(xì)胞的特異性：定居于一定部位的細(xì)菌，能選擇性地粘附某一類型的上皮細(xì)胞。 例如:同是在呼吸道定居的致病菌，腦膜炎球菌特異地粘附非纖毛上皮細(xì)胞，多殺巴氏桿菌(pasteurelIa multieida)能特異地粘附鱗狀上皮細(xì)胞，百日咳桿菌則粘附于支氣管纖毛上皮細(xì)胞。 同一型細(xì)胞表面成分

4、改變后，能被不同的細(xì)菌粘附:頰粘膜細(xì)胞表面包被血漿纖維粘連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)n)時，有革蘭氏陽性菌粘附，無Fn時，粘附革蘭氏陰性菌，F(xiàn)n存在一定量時，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均可粘附。特異性粘附需要的物質(zhì)基礎(chǔ) 細(xì)菌表面的粘附結(jié)構(gòu)粘附素 宿主細(xì)胞表面的特異性受體配體（粘附素）和受體 細(xì)菌表面的特異識別分子配體(ligand)和宿主上皮細(xì)胞表面對應(yīng)的識別分子受體(receptor)是細(xì)菌實現(xiàn)粘附的物質(zhì)基礎(chǔ)，二者互相緊密粘附結(jié)合，有利于細(xì)菌定居、繁殖、內(nèi)化（侵襲）和致病。配體粘附素 使細(xì)菌粘附在敏感細(xì)胞的表面，利于細(xì)菌的定植、繁殖,與細(xì)菌的致病性密切相關(guān)，稱為粘附素。根據(jù)來源分為菌毛

5、粘附素和非菌毛粘附素。 菌毛粘附素：由細(xì)菌菌毛分泌并存在于菌毛頂端； 非菌毛粘附素：來自于細(xì)菌表面的其他組分，如G-菌外膜蛋白和G+菌細(xì)胞壁。如鼠疫桿菌的外膜蛋白、A群鏈球菌細(xì)胞壁的脂磷壁酸等。菌毛粘附素 普通菌毛是細(xì)菌的粘附結(jié)構(gòu)，能與宿主細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，菌毛的受體常為糖蛋白或糖脂，與菌毛結(jié)合的特異性決定了宿主感染的易感部位。有菌毛的粘附可抵抗腸蠕動或尿液的沖洗作用而有利于定居，一旦喪失菌毛，其致病力亦隨之消失。許多細(xì)菌導(dǎo)致人類疾病,菌毛介導(dǎo)粘附到宿主細(xì)胞是哺乳動物感染的第一步。經(jīng)常引發(fā)細(xì)菌粘附的細(xì)胞骨架的重排。細(xì)菌可以通過自然哺乳動物宿主信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為吞噬作用準(zhǔn)備宿主骨架。bact

6、eriaAfimbrial adhesins on the cell surfaceAfimbrial Adhesins鞭毛（霍亂弧菌，百日咳桿菌，空腸彎曲菌），鞭毛（霍亂弧菌，百日咳桿菌，空腸彎曲菌），血凝素（霍亂弧菌，幽門螺桿菌），血凝素（霍亂弧菌，幽門螺桿菌），表面蛋白（志賀氏菌），表面蛋白（志賀氏菌），LTA（多數(shù)（多數(shù)G菌）菌）Used by many bacteria, particularly Gram (+)Individual proteins or clusters of protein on the cell surface mediate a tight interac

7、tion with host cells細(xì)菌細(xì)胞壁細(xì)菌細(xì)胞壁非菌毛粘附素的粘附機制壁磷壁酸參與細(xì)菌粘附的作用機理壁磷壁酸參與細(xì)菌粘附的作用機理:a.磷壁酸的游離端可以直接與宿主細(xì)胞的表面分子(受體)結(jié)合;b.磷壁酸分子本身帶負(fù)電荷，可以與宿主細(xì)胞表面帶正電荷的大分子或大分子的某些帶正電區(qū)域結(jié)合;c.磷壁酸與細(xì)菌本身的表面蛋白結(jié)合，通過表面蛋白介導(dǎo)再與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合，此時的磷壁酸和蛋白質(zhì)共同組成粘附因子。可見，壁磷壁酸在致病性方面具有重要意義。脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)粘附機制 a.LTA的重復(fù)單位及疏水鏈都含有脂質(zhì)結(jié)合點，它們可以與宿主細(xì)胞表面的脂質(zhì)區(qū)結(jié)合，特

8、別是一些糖脂及脂蛋白受體; b.細(xì)菌在生長過程中不斷向周圍釋放LTA(或dLTA)，其中一部分LTA是游離的，而另一部分則通過鏈的親水端與細(xì)菌表面蛋白結(jié)合，能與膜結(jié)合的疏水端則有機會同宿主細(xì)胞表面的脂質(zhì)受體或蛋白質(zhì)受體結(jié)合; c.LTA分子本身帶弱負(fù)電荷，它的游離端可直接與宿主細(xì)胞表面帶正電荷的大分子(或某一部分)結(jié)合，從而介導(dǎo)細(xì)菌的粘附。宿主細(xì)胞表面的特異性受體 宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜 脂質(zhì)雙層：脂類、蛋白質(zhì) 細(xì)胞表面的粘附受體 整合素、鈣粘蛋白、免疫球蛋白超家族、選擇素 ECM(extracellular,matrix) 由細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的大量分子構(gòu)成細(xì)胞外復(fù)雜的結(jié)構(gòu)網(wǎng)，包括纖連蛋白、纖維素蛋白

9、原、膠原蛋白、蛋白聚糖和粘多糖粘附素與相應(yīng)受體細(xì)菌的特異性粘附機制 直接粘附 間接粘附-經(jīng)由ECM蛋白的粘附 EPEC粘附細(xì)菌粘附實驗?zāi)Ｐ图?xì)菌粘附實驗?zāi)Ｐ蛣游锬Ｐ蛣游锬Ｐ驼衬ど掀そM織體外粘附粘膜上皮組織體外粘附模型模型細(xì)胞模型細(xì)胞模型細(xì)菌粘附研究實驗方法動物模型 是細(xì)菌粘附研究中應(yīng)用最早最廣泛的實驗?zāi)Ｊ羌?xì)菌粘附研究中應(yīng)用最早最廣泛的實驗?zāi)Ｐ停蛇x普通動物，型，可選普通動物，SPF 動物，動物，GF動物。動物。 形成動物模型的條件中，外因包括所用細(xì)菌形成動物模型的條件中，外因包括所用細(xì)菌濃度、實驗步驟、動物機體的免疫狀態(tài)，內(nèi)濃度、實驗步驟、動物機體的免疫狀態(tài)，內(nèi)因動物的品種、細(xì)胞的受體系統(tǒng)和選用

10、菌株因動物的品種、細(xì)胞的受體系統(tǒng)和選用菌株的特性。的特性。 細(xì)菌粘附動物模型應(yīng)用過細(xì)菌粘附動物模型應(yīng)用過程中可長時間觀察細(xì)菌的程中可長時間觀察細(xì)菌的粘附作用，也可用于短期粘附作用，也可用于短期觀察。長時間觀察可通過觀察。長時間觀察可通過定期檢測動物排泄物中攻定期檢測動物排泄物中攻擊菌的數(shù)量間接反映細(xì)菌擊菌的數(shù)量間接反映細(xì)菌的粘附的粘附;短期觀察通過將短期觀察通過將動物急性處死后，通過對動物急性處死后，通過對粘附與粘膜上皮表面的細(xì)粘附與粘膜上皮表面的細(xì)菌進行掃描電鏡觀察或進菌進行掃描電鏡觀察或進行細(xì)菌培養(yǎng)計數(shù)來確定細(xì)行細(xì)菌培養(yǎng)計數(shù)來確定細(xì)菌在粘膜上皮表面有無粘菌在粘膜上皮表面有無粘附及粘附能力的

11、強弱。附及粘附能力的強弱。細(xì)胞模型 近年來應(yīng)用較多的一類細(xì)菌粘附模型，具有近年來應(yīng)用較多的一類細(xì)菌粘附模型，具有重復(fù)性好和周期短的優(yōu)點，如重復(fù)性好和周期短的優(yōu)點，如Hela細(xì)胞（人細(xì)胞（人子宮宮頸癌上皮細(xì)胞）子宮宮頸癌上皮細(xì)胞） Int407407 細(xì)胞細(xì)胞(人胚胎人胚胎腸粘膜細(xì)胞系腸粘膜細(xì)胞系)Vero細(xì)胞（非洲綠猴腎異倍細(xì)胞（非洲綠猴腎異倍體細(xì)胞）體細(xì)胞） CHO細(xì)胞（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）細(xì)胞（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）等。等。由于這些細(xì)胞系多為來自腫瘤細(xì)胞的無限由于這些細(xì)胞系多為來自腫瘤細(xì)胞的無限繁殖細(xì)胞系已失去某些細(xì)胞表面的受體標(biāo)志，繁殖細(xì)胞系已失去某些細(xì)胞表面的受體標(biāo)志，現(xiàn)在開始采用原代培養(yǎng)細(xì)

12、胞作為細(xì)胞粘附?，F(xiàn)在開始采用原代培養(yǎng)細(xì)胞作為細(xì)胞粘附模型用細(xì)胞。型用細(xì)胞。粘膜上皮組織體外粘附模型 為近年來受到重視的一類細(xì)菌粘附模型，此為近年來受到重視的一類細(xì)菌粘附模型，此模型可避免動物模型中各種干擾因素的影響，模型可避免動物模型中各種干擾因素的影響，方便、重復(fù)性好為一類能直接反應(yīng)細(xì)菌粘附方便、重復(fù)性好為一類能直接反應(yīng)細(xì)菌粘附素與細(xì)胞表面受體相互作用的理想模型。素與細(xì)胞表面受體相互作用的理想模型。粘膜上皮組織選擇的原則：粘膜上皮組織選擇的原則：.受體特異性受體特異性原則原則.年齡選擇，月齡以上胎兒的胃年齡選擇，月齡以上胎兒的胃腸道粘膜上皮組織表面的大部分受體系統(tǒng)才腸道粘膜上皮組織表面的大部

13、分受體系統(tǒng)才能充分表達。能充分表達。.部位選擇，細(xì)菌對同一組部位選擇，細(xì)菌對同一組織器官不同部位粘膜上皮組織的粘附能力有織器官不同部位粘膜上皮組織的粘附能力有較大差異較大差異。 粘膜上皮組織體外模型的應(yīng)用注意事項：粘膜上皮組織體外模型的應(yīng)用注意事項：.粘膜上皮組織片的制備，先將上皮組織均粘膜上皮組織片的制備，先將上皮組織均勻展平后用固定，粘膜上皮片組織勻展平后用固定，粘膜上皮片組織片大小要均勻。片大小要均勻。.細(xì)菌活力的維持。細(xì)菌活力的維持。.非特異性粘附的減少或避免非特異性粘附的減少或避免 。Section twoInvasion(internalization) Obtaining nut

14、rients Avoid host defenses指某些毒力強或具有侵襲能力的病原菌主動侵入非指某些毒力強或具有侵襲能力的病原菌主動侵入非吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞（主要為粘膜上皮細(xì)胞）（主要為粘膜上皮細(xì)胞）的感染過程。的感染過程。侵襲素：侵襲素： Entry Intracellular life-style The vacuole as an intracellular replication compartment Life in the cytosol and actin-based intra- and intercelluar motility Cell responses to intra

15、cellular pathogensBacterial InvasionSteps in bacterial invasionThe Zipper Mechanism of EntryThe Trigger Mechanism of Entry一、一、Entry MechanismsEntry MechanismsAlicia E. Smith and Ari Helenius Science 304 237 (2004)The Zipper Mechanism of Entry：Contact and adherencePhagocytic cup formationthree succes

16、sive stepsreceptor clusteringActin polymerizationMembrane extensionTransient signalstriggerPhagocytic cup closure and retraction, and actin depolymerization配體介導(dǎo)的內(nèi)化配體介導(dǎo)的內(nèi)化拉鏈?zhǔn)嚼準(zhǔn)絑ipper model for invasin-mediatedBacteriumIntegrin receptorsECMActinNot sufficient receptors for internalization of bacteria

17、 because most of theb b1-integrin population is bound to ECM.Zipper model for invasin-mediatedBacteriumECMActinIntegrin receptorsbut due to high affinity binding of invasin to integrins the receptors are sequestred and the bacteria begins to be internalizedZipper mechanism耶爾森氏菌Yersinia侵襲素侵襲素Invasin

18、-整合素整合素Integrin李氏桿菌Listeria內(nèi)化素內(nèi)化素Internalin -鈣粘連蛋白鈣粘連蛋白 E cadherinInlB-Met Graphic of the Yersinia uptake mechanism（A）“拉鏈”機制，主要見于耶爾森菌和李斯特菌； （B）“觸發(fā)”機制，主要見于沙門菌和志賀菌。排排他他性，性，個個體體行行為為The Zipper Mechanism of Entry：配體介導(dǎo)的內(nèi)化配體介導(dǎo)的內(nèi)化Entry MechanismsEntry MechanismsAlicia E. Smith and Ari Helenius Science 304 2

19、37 (2004)The Trigger Mechanism of Entry：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞膜皺變細(xì)胞膜皺變Four successive stepspre-interaction stageinteraction stageformation of a macropinocytic pocketActin depolymerization and closing of the macropinocytic “巨胞飲” pocketEffector moleculesDedicated chaperonesThe formation of a signaling platform

20、avoid premature association of the effector molecules and their proteolytic degradationLocalized but massive rearrangement of the cell surfaceCharacterizations:The formation of intricate filopodial and lamellipodial structures觸發(fā)式觸發(fā)式Trigger mechanismSalmonella SPI-1 Type III secretion system “trigger

21、s” invasion頂面（api-cal surface）ShigellaMxi-Spa Type III secrection system “triggers” invasion基底面（basolat-eral face）M cells: the weak point of the intestinal epitheliumMembranous epithelial cells (M cells) are key sites of antigen sampling for the mucosal-associated lymphoid systemCossart and Sansonet

22、ti, Science 2004Model of invasion of the intestinal epithelium by SalmonellaInvasion of the intestinal epithelium by ShigellaCossart and Sansonetti, Science 2004兼兼容容性，性，群群體體行行為為The Trigger Mechanism of Entry：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞膜皺變：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞膜皺變in vitro invasion and in vivo invasion experiment Cell model：粘附試驗：粘附試驗：1.培養(yǎng)細(xì)胞于培養(yǎng)細(xì)胞于 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（內(nèi)置載玻片）孔細(xì)胞培養(yǎng)板（內(nèi)置載玻片） 2.加入細(xì)菌（計數(shù)，標(biāo)記），培養(yǎng)加入細(xì)菌（計數(shù)，標(biāo)記），培養(yǎng) 1 . 5 h 3.用用 Hanks 液洗液洗 6 次次 4.加入含加入含 1 %TritonX - 100 的的 PBS 10min 5.吸出各孔懸液吸出各孔懸液 , 稀釋稀釋 , 傾注培養(yǎng)基，培養(yǎng)傾注培養(yǎng)基，培養(yǎng),計數(shù)菌落數(shù)。計數(shù)菌落數(shù)。細(xì)菌侵襲實驗：細(xì)菌侵襲實驗：1.培養(yǎng)細(xì)胞于培養(yǎng)細(xì)胞于 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（內(nèi)置載玻片）孔細(xì)胞培養(yǎng)板（內(nèi)置載玻片） 2.加入細(xì)菌（