實(shí)驗(yàn)8_植物基因組DNA的提取20101104

1、植物基因組植物基因組DNADNA的提取的提取及及純度與含量的測(cè)定純度與含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)八實(shí)驗(yàn)八20101104第一部分第一部分植物基因組植物基因組DNADNA的提取的提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笠?、?shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵? 1、學(xué)習(xí)并掌握植物基因組、學(xué)習(xí)并掌握植物基因組DNADNA的提取原理和方法；的提取原理和方法；2 2、了解瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)核酸的原理和操作；、了解瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)核酸的原理和操作；3 3、學(xué)習(xí)并掌握對(duì)電泳檢測(cè)基因組、學(xué)習(xí)并掌握對(duì)電泳檢測(cè)基因組DNADNA結(jié)果的初步分析。結(jié)果的初步分析。二、實(shí)驗(yàn)基本原理二、實(shí)驗(yàn)基本原理 植物基因組DNA的提取一般經(jīng)過破碎細(xì)胞壁、裂解細(xì)胞膜、除去多糖和酚等

2、次生物質(zhì)、變性蛋白質(zhì)、沉淀核酸、去除RNA和濃縮DNA等幾個(gè)步驟。 傳統(tǒng)提取方法主要有二種：十六烷基三乙基溴化銨（CTAB)法、十二烷基硫酸鈉 (SDS)法。其基本原理是：十六烷基三甲基溴化銨和十二烷基硫酸鈉等離子型表面活性劑，能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。再加入苯酚和氯仿等有機(jī)溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強(qiáng)，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細(xì)胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入無水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，加入RNA酶去除核酸中的RNA,即得植物基因組 DNA溶液。 由于植物中的次生代謝產(chǎn)物多酚類化合物可介

3、導(dǎo)DNA降解，而多糖的污染也是影響植物核酸純度最常見的問題，這些多糖能抑制限制酶、連接酶及DNA聚合酶等分子生物學(xué)酶類的生物活性。傳統(tǒng)的CTAB-DNACTAB-DNA提取法提取法步驟多，較煩瑣，DNA產(chǎn)率低，而且由于酚很難完全去除，容易影響以后的酶切等工作的效率。SDSSDS法法操作簡單，溫和,也可提取到較高分子量DNA，但所得產(chǎn)物含糖類雜質(zhì)較多,這將直接影響DNA的限制性核酸內(nèi)切酶酶切效果。由于植物細(xì)胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對(duì)DNA的抽提產(chǎn)生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強(qiáng)還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。 本實(shí)驗(yàn)采用十二烷基硫酸鈉 (SDS)法提取植物基因

4、組DNA，基因組DNA提取后，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因組DNA分子量大小、純度；用紫外吸收法紫外吸收法測(cè)定測(cè)定基因組DNA純度與含量。DNADNA的瓊脂糖凝膠電泳鑒定的瓊脂糖凝膠電泳鑒定: : DNA分子在瓊脂糖凝膠中有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，它在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即具有不同的相對(duì)分子量的DNA片段泳動(dòng)速度不同。DNA片斷在凝膠中當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙錠（EB）染色后，在紫外光下可見橙紅色帶，并可確定DNA片斷在凝膠中的位置。影響影響DNADNA泳動(dòng)速率（遷移率）的因素有

5、：泳動(dòng)速率（遷移率）的因素有： DNADNA分子質(zhì)量的影響：分子質(zhì)量的影響：雙鏈DNA分子遷移的速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比。分 子量越大，遷移率越小。 DNADNA構(gòu)型的影響：構(gòu)型的影響：超螺旋DNA線狀DNA開環(huán)DNA 膠濃度的影響：膠濃度的影響： 濃度越低，相同核酸分子遷移越快，一般常用的凝膠濃度 為12； 電場(chǎng)強(qiáng)度的影響：電場(chǎng)強(qiáng)度的影響：電場(chǎng)強(qiáng)度愈大，帶點(diǎn)顆粒的泳動(dòng)越快。但凝膠的有效分 離范圍隨著電壓增大而減小，所以電泳時(shí)一般采用低電壓，（一般5V/cm） （電場(chǎng)強(qiáng)度） 。而對(duì)于大片段電泳，甚至用0.51.0V/cm電泳過夜。進(jìn)行 高壓電泳時(shí)，只能使用聚丙烯酰胺凝膠。 EBEB的影響：

6、的影響：溴化乙錠（EB）插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長度增 加。 電泳緩沖液的影響電泳緩沖液的影響: :核酸電泳常采用TAE、TBE、TPE三種緩沖系統(tǒng)，但它們 各有利弊。TAE價(jià)格低廉，但緩沖能力低，必須進(jìn)行兩極緩沖液的循環(huán)。 TPE在進(jìn)行DNA回收時(shí)，會(huì)使DNA污染磷酸鹽，影響后續(xù)反應(yīng)。所以多采用 TBE緩沖液。在緩沖液中加入EDTA，可以鰲合二價(jià)離子，抑制DNase，保護(hù) DNA。緩沖液pH常偏堿性或中性，此時(shí)核酸分子帶負(fù)電，向正極移動(dòng)。 堿基組成與電泳溫度的影響堿基組成與電泳溫度的影響: : 一般影響不大在在DNADNA提取過程中必須始終注意以下幾個(gè)關(guān)鍵問題：提取過程中必須始

7、終注意以下幾個(gè)關(guān)鍵問題：（1）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和雙鏈易受多種因素（如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、加熱、低鹽濃度、有機(jī)溶劑、酰胺類、尿素等）的影響引起雙鏈解開，即“變性”，因此抽提時(shí)避免使用變性的條件。（2）抑制內(nèi)外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜絕，現(xiàn)可以通過多種途徑來做到這一點(diǎn)：a、低溫操作；b、調(diào)節(jié)pH，使偏堿（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性劑；d、加螯合劑（EDTA）除去酶的鋪助因子（Mg2+），使酶活性喪失。（3）防止化學(xué)降解。如過酸或過堿以及其它化學(xué)因素，會(huì)使DNA降解，一般綜合考慮，取pH8.0左右為宜。（4）防止物理因素降解。如溫度太高或

8、機(jī)械張力剪切等，DNA分子特別大，極易被機(jī)械張力拉斷，甚至在細(xì)管中稍急一些的流動(dòng)也會(huì)使DNA斷裂，所以在抽提過程中要特別注意這一點(diǎn)，操作過程要盡量簡便、溫和、減少攪拌次數(shù)，也不要?jiǎng)×覔u動(dòng)。（5）植物的次生代謝物（主要是胞質(zhì)內(nèi)的多酚類或色素類化合物）對(duì)核酸提取有干擾作用。因此，一般盡可能選幼嫩的、代謝旺盛的新生組織作為提取DNA的材料，這是因幼嫩的新生組織次生代謝物較少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鮮的。三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)材料：植物幼嫩葉子2、實(shí)驗(yàn)試劑（1）基因組DNA提取緩沖液（2）氯仿:異戊醇:乙醇抽提液（3）TE緩沖液（4）平衡酚：（5）RNA酶A（

9、6）酚/氯仿（7）氯仿/異戊醇（8）異丙醇、無水乙醇、70%乙醇。（9） 3mol/L NaAc（10） 5TBE緩沖液（11） 6電泳上樣緩沖液（12） 1.0%瓊脂糖凝膠（13） EB（14） DNA分子量Markers： 125，564，2027，2322，4361，6557，9416，23130bp.四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器1、研體2、離心機(jī)、離心管（7ml）及離心管架；3、微量移液器10ul、1000ul及槍頭；4、恒溫水浴箱65 5、制冰機(jī)；6、冰箱； 7、恒溫水浴箱 37；8、微波爐； 9、電泳儀及電泳槽；10、紫外檢測(cè)儀。五、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟五、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟

10、 置于預(yù)熱到65的研體中，加少許石英砂；加入預(yù)熱到65的核酸提取緩沖液3ml稱取植物幼嫩葉子0.5g迅速研成勻漿轉(zhuǎn)移到7ml帶蓋離心管中65水浴保溫1hr，其間經(jīng)常輕柔搖動(dòng)加入3ml氯仿-異戊醇-乙醇溶液輕柔顛倒混勻后，室溫靜置分層5min離心5,000g5min上清液轉(zhuǎn)移到干凈7ml離心管中，記錄體積，棄沉淀，* *加入等體積異丙醇試劑，混和后靜置20min沉淀DNA4離心5,000g3 min收集絮狀沉淀加入3mlTE，65水浴中助溶15min，使之完全溶解加入等體積的平衡酚，輕柔顛倒混勻，室靜置10min4離心12,000g10min轉(zhuǎn)移上清于新7ml離心管中，記錄體積* *加入1/2體

11、積的平衡酚與1/2體積的氯仿，輕柔顛倒混勻，室溫放置15min4離心（12,000g，5min）吸取上清轉(zhuǎn)移到一新7ml離心管中，記錄體積* *加入等體積的氯仿，顛倒混勻，室溫放置5min4離心（12,000g，10min）吸取上清轉(zhuǎn)移到一新7ml離心管中，記錄體積* *加入5l RNase（5g/l），37 保溫10min加入1/10體積3mol/L NaAC和2體積20預(yù)冷的無水乙醇20放置20min * *4離心（5,000g，3min）收集沉淀* *用70%乙醇洗滌沉淀，傾倒掉乙醇溶液，干燥，讓酒精完全揮發(fā)用1mlTE溶解沉淀，即為植物基因組DNA溶液* *凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA（分

12、子量大小、純度）4保存?zhèn)溆谜f明：如果蛋白質(zhì)和RNA未去除干凈，重復(fù)酚，酚/氯仿，氯仿抽提步驟，繼續(xù)用RNase處理，乙醇沉淀和洗滌，重溶于TE中，直至基因組DNA純度和質(zhì)量符合要求。（一）（一） 植物基因組植物基因組DNADNA的提取的提取 紫外吸收法測(cè)定基因組DNA純度與含量* *植物基因組植物基因組DNADNA的提取操作過程現(xiàn)象的提取操作過程現(xiàn)象* *植物基因組植物基因組DNADNA的提取操作過程現(xiàn)象的提取操作過程現(xiàn)象1、制膠制膠（1瓊脂糖凝膠） 在膠模上架好梳子。稱取01g瓊脂糖，置于250ml錐形瓶中，加100ml 0.5TBE電泳緩沖液，加熱熔化至無顆粒狀瓊脂糖，待其冷卻至5060后

13、，加入EB，使其終濃度為0.5mg/L，搖勻后立即倒入準(zhǔn)備好的膠模中，待膠凝固后，放入電泳槽中，倒入適量0.5TBE（剛好淹過膠面），拔去梳子備用。（注：EB為誘變劑、致癌物，接觸凝膠必須戴手套操作）2 2、加樣、加樣 取5ul純化的DNA原溶液樣品，與1ul 6電泳加樣緩沖液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中（注：勿劃破或戳穿加樣孔，勿帶入氣泡）。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個(gè)樣品要換槍頭以防互相污染。注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。3 3、電泳、電泳 加完樣后，蓋上電泳槽蓋，立即接通電源，使電壓調(diào)到100V，恒壓

14、電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前緣約2cm時(shí)，停止電泳（約需3060min）。4 4、觀察和拍照、觀察和拍照 取出膠塊置于紫外燈下觀察，DNA存在處可顯示出肉眼可辨的橘紅色熒光帶，再用成像儀進(jìn)行拍照，以便于分析。（注：紫外光對(duì)眼睛有害，觀察時(shí)戴上防護(hù)鏡或眼鏡，或隔著玻璃或有機(jī)玻璃觀察）。（二）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組（二）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNADNA第二部分第二部分基因組基因組DNADNA純度與含量的測(cè)定純度與含量的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笠?、?shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、學(xué)習(xí)紫外吸收法測(cè)定核酸基本原理和方法；2、學(xué)習(xí)并掌握紫外吸收法測(cè)定基因組DNA純度與含量的方法。二、實(shí)驗(yàn)基本原理二、實(shí)驗(yàn)基本原理

15、 核酸DNA和RNA所含堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)（嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)）的共軛雙鍵具有紫外吸收的性質(zhì)，它們?cè)?60nm處有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波長進(jìn)行核酸含量的測(cè)定。 波長為260nm時(shí)，DNA或RNA的光密度的大小不僅與總含量有關(guān)，也與它們的不同構(gòu)型而有差異。 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品來說，濃度為1g / ml時(shí)，DNA鈉鹽的OD2600.02。 當(dāng)當(dāng)ODOD2602601 1時(shí)，雙鏈時(shí)，雙鏈DNADNA含量約為含量約為50g / ml50g / ml 單鏈DNA含量約為37g / ml RNA含量約為40g / ml 寡核苷酸含量約為30g / ml（由于底物不同有差異）1 1、核酸樣品、核酸樣品DNA

16、DNA、RNARNA含量的測(cè)定：含量的測(cè)定： 如用用1cm1cm光徑光徑石英比色皿石英比色皿，用 H2O稀釋DNA或RNA樣品n倍并以H2O為空白對(duì)照，根據(jù)此時(shí)讀出的OD260值即可計(jì)算出樣品稀釋前DNA的含量： DNA（g/l）=50OD260讀數(shù) DNA樣品稀釋倍數(shù)/1000 RNA（g/l）=40OD260讀數(shù) RNA樣品稀釋倍數(shù)/1000 若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時(shí)無法用分光光度法對(duì)核酸進(jìn)行定量，可使用溴化乙錠法或其他方法進(jìn)行估算。 當(dāng)DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時(shí)，會(huì)影響DNA吸光度的準(zhǔn)確測(cè)定。由于 DNA在260nm處有最大的吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大

17、的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。所以，一般情況下同時(shí)檢測(cè)同一樣品的OD260、OD280和OD230，計(jì)算它們的比值來判斷核酸樣品的純度。2 2、核酸樣品純度判斷的一般標(biāo)準(zhǔn)：、核酸樣品純度判斷的一般標(biāo)準(zhǔn)： DNA純度：OD260/OD2801.8，表示為純的DNA； OD260/OD280 1.9，表示有RNA污染； OD260/OD280 1.6，表示有蛋白質(zhì)、酚等污染。 RNA純度：1.7 OD260/OD2802.0，表示為純的RNA； OD260/OD280 1.7時(shí)，表示有蛋白質(zhì)或酚污染； OD260/OD280 2.0時(shí)，表示可能有異硫氰酸殘存。 OD230/OD260的

18、比值應(yīng)在0.4-0.5之間，若比值較高說明有殘余的鹽和小分子如核苷酸、氨基酸、酚等的存在。 若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時(shí)無法用分光光度法對(duì)核酸進(jìn)行定量；同時(shí)也會(huì)影響酶切和PCR的效果。三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)材料 植物基因組DNA樣品2、實(shí)驗(yàn)試劑 ddH2O； TE緩沖液（pH 8.0）。四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器1、離心機(jī)、離心管（5ml）及離心管架；2、微量移液器10ul、200ul、1000ul及槍頭；3、紫外分光光度計(jì)；4、石英比色皿（0.5cm光徑）或1cm光徑的微量石英比色皿（50ul、100ul）。五、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟五、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟 方法方法1 1： 將提取的植物基因組DNA樣品吸取20ul，加到新的5ml離心管中，再加一定量的ddH2O 或TE緩沖液（pH 8.0）稀釋100倍，用用0.5cm0.5cm光徑石英比色皿光徑石英比色皿（約需1.6ml樣品溶液）或微量石英比色皿微量石英比色皿在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定230nm、260nm、28