甲基化進(jìn)展ppt課件

1、肺癌甲基化的研究方向甲基化的檢測方法甲基化的檢測方法一、甲基化特異性一、甲基化特異性PCR（MSP）n用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設(shè)計(jì)針對甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過電泳檢測MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說明該位點(diǎn)存在甲基化；反之，說明被檢測的位點(diǎn)不存在甲基化?；蚪MDNA未甲基化C U甲基化C 不變亞硫酸鹽PCR（引物）針對位點(diǎn)不同MSP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測擴(kuò)增：甲基化不擴(kuò)增：無甲基化n二、亞硫酸氫鹽測序法（BSP）n用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，則未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化

2、為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，最后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化稱為BSP-直接測序方法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測序法。甲基化C 不變（BSP引物）PCR未甲基化C UTC測序有：甲基化無：甲基化n三、高分辨率熔解曲線法（HRM）n在非CpG島位置設(shè)計(jì)一對針對亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物，這對引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發(fā)生了甲基化，用亞硫酸氫鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變

3、，樣品中的GC含量發(fā)生改變，從而導(dǎo)致熔解溫度的變化。在肺癌中主要研究方向在肺癌中主要研究方向n1、腫瘤早期篩查。n2、肺部疾病輔助診斷。n3、復(fù)發(fā)監(jiān)測。腫瘤早期篩查腫瘤早期篩查腫瘤早期篩查腫瘤早期篩查The role of DNA methylation in the development and progression of lung adenocarcinoma Disease Markers 23 (2007) 530疾病進(jìn)展雜合缺失位點(diǎn)基因突變出現(xiàn)甲基化改變的基因結(jié)論：結(jié)論：DNA甲基甲基化標(biāo)志物的診斷化標(biāo)志物的診斷、分類和預(yù)測可、分類和預(yù)測可以大大有益于臨以大大有益于臨床，可用于早

4、期床，可用于早期診斷、治療策略診斷、治療策略的確定和治療效的確定和治療效果的評價。果的評價。The role of DNA methylation in the development and progression of lung adenocarcinoma Disease Markers 23 (2007) 530肺部疾病輔助診斷肺部疾病輔助診斷肺部疾病輔助診斷肺部疾病輔助診斷研究背景：疾病特異性的研究背景：疾病特異性的cfDNA甲基化位點(diǎn)被認(rèn)為是輔助診斷的理想標(biāo)志甲基化位點(diǎn)被認(rèn)為是輔助診斷的理想標(biāo)志物。本研究對肺部組織進(jìn)行全基因組甲基化檢測，篩選出鑒別肺癌、肺間物。本研究對肺部組織進(jìn)行

5、全基因組甲基化檢測，篩選出鑒別肺癌、肺間質(zhì)病和慢阻肺的分子標(biāo)志物。質(zhì)病和慢阻肺的分子標(biāo)志物。450芯片檢測129例肺部組織，篩選分子標(biāo)志物驗(yàn)證129例肺部組織cfDNA甲基化檢測：204例血漿標(biāo)本診斷分類甲基化驗(yàn)證：46例血漿標(biāo)本篩選出222個甲基化位點(diǎn)篩選出64個甲基化位點(diǎn)4基因模型方法：入組129例肺癌、ILD、COPD患者，對組織標(biāo)本進(jìn)行450K芯片檢測，篩選各類疾病特異性的甲基化位點(diǎn)。選取204例肺癌、ILD、COPD患者，分別收集400ul血漿，提取cfDNA，經(jīng)MSRE處理，通過qPCR篩選DNA特異性甲基化分子標(biāo)志物，建議疾病鑒別模型。區(qū)分組區(qū)分組靈敏性靈敏性特異性特異性癌癥組與

6、非癌癥組87.8%90.2%肺癌組與ILD88%肺癌組與COPD88%ILD、COPD與健康人63.1%70%紅色：肺癌藍(lán)色：ILD綠色：COPD紫色：正常結(jié)論：結(jié)論：cfDNA甲基化測序能夠區(qū)分肺癌、甲基化測序能夠區(qū)分肺癌、ILD/COPD和健康人群。和健康人群。在手術(shù)切除小細(xì)胞肺癌中在手術(shù)切除小細(xì)胞肺癌中CpG島甲基化表型的預(yù)后意義島甲基化表型的預(yù)后意義研究目的：闡明小細(xì)胞肺癌的綜合基因組甲基化的臨床病理特征和預(yù)后治療的關(guān)系研究背景：DNA甲基化相關(guān)基因沉默在人類癌癥中是一種常見的事件，全球低甲基化是被認(rèn)為在原發(fā)性肺癌中染色體不穩(wěn)定性增加的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。然而，啟動子CPG島的持

7、續(xù)抑制其下游基因局部甲基化，包括抑癌基因。CPG島甲基化表型（CIMP）在結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌中呈現(xiàn)了DNA甲基化的特征性改變。紅色：高甲基化 綠色：低甲基化1組是9例 CIMP高表達(dá)的，2組是19例 低表達(dá)CIMPCIMP：cPG島甲基化表型，涉及多個基因啟動子同時甲基化，與腫瘤發(fā)生及預(yù)后相關(guān)。通過DNA甲基化分析技術(shù)，我們得到兩類不同甲基化模式與不同的預(yù)后。中位無疾病生存期Cluster1:2=9.6vs86.9m結(jié)論：在小細(xì)胞肺癌結(jié)論：在小細(xì)胞肺癌中中CIMP可以作為手可以作為手術(shù)后預(yù)后的重要指標(biāo)術(shù)后預(yù)后的重要指標(biāo).研究局限性研究局限性n1.例數(shù)少n2.所有樣本均為手術(shù)標(biāo)本n3

8、.沒有驗(yàn)證集n4.有無術(shù)前化療的影響。背景：目前， DNA 甲基化異常被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的早期事件，也是組織發(fā)生癌變的重要原因之一。腫瘤病人血液游離 DNA（ cirDNA）中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腫瘤特異的甲基化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的檢測或可開創(chuàng)腫瘤無創(chuàng)診斷新方法方法：入組 32 例健康人群和 60 例肺癌患者， qMSP 技術(shù)檢測患者在新輔助化療前、后及手術(shù)切除后血漿中的 RASSF1A 和 RARB2 基因甲基化變化。結(jié)果： RASSF1A 和 RARB2 基因甲基化可以區(qū)分腫瘤患者和健康人群，靈敏度和特異性分別為 87%和 75%，腫瘤患者基因甲基化水平是健康人群的 2-3 倍。進(jìn)展期肺癌患者 RARB2甲基化水平高，而 RASSF1A 并無顯著變化?；颊咴谛螺o助化療后和手術(shù)后，血漿游離 DNA中 RASSF1A 和 RARB2 基因甲基化水平顯著降低。在術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)， 9 個月時，血漿游離 DNA 中 RASSF1A 和 RARB2 基因甲基化水平升高，患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)跡象結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn) RA