不同氮、磷濃度對微藻生長代謝的影響

1、不同氮、磷濃度對微藻生長代謝的影響1 目的與意義扁藻（Tetraselmis Chui）隸屬于綠藻門、綠藻綱、團(tuán)藻目、衣藻科的海藻。扁藻作為海產(chǎn)品幼體前期的優(yōu)質(zhì)植物性餌料，對海產(chǎn)品幼體的生長發(fā)育有著極其重要的作用。對所投喂的動物性餌料，如輪蟲、裸腹蛋、豐年蟲等起著良好的同步強(qiáng)化作用；通過扁藻的光合作用，能降低并消除育苗水體的有機(jī)污染和其他有害物質(zhì)，并為水體提供充足的氧氣，保持養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)的良性循環(huán)，達(dá)到改善水質(zhì)目的。鹽藻（Duanziezla salsna）隸屬于綠藻門、綠藻綱、團(tuán)藻目、鹽藻科的海藻，其原生質(zhì)裸露，體形變化很大，單細(xì)胞、無細(xì)胞壁、具兩條等長鞭毛。鹽藻的人工培養(yǎng)始于20世紀(jì)60年

2、代，主要用于魚、蝦、貝類幼體的餌料。真正以提取-胡蘿卜素為目的的鹽藻培養(yǎng)始于20世紀(jì)70年代。鹽藻在代謝過程中除積累-胡蘿卜素外，鹽藻在以海水為培養(yǎng)基培養(yǎng)時，可積累大量的蛋白質(zhì)，含量高達(dá)細(xì)胞干重的5060%，其中含有包括人類必需氨基酸在內(nèi)的18種氨基酸，是一種優(yōu)良的蛋白飼料或人類食品加工原料。鹽藻在脅迫的環(huán)境中還積累大量的甘油，含量高達(dá)干重的80%。天然甘油是優(yōu)質(zhì)的化妝品原料，同時也是化工、輕工和醫(yī)藥工業(yè)的重要原料。綠色鹽藻藻體內(nèi)還含有的植物蛋白、脂肪酸、多糖、葉綠素、甘油等多種營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，可應(yīng)用于人體保健、生物制藥、基因工程等領(lǐng)域，開發(fā)天然保健品或生物藥品以及耐鹽基因應(yīng)用研究，具

3、有一定的應(yīng)用價值，具有廣闊的應(yīng)用前景。微藻生長所需要的營養(yǎng)元素有1520種，天然水體或土壤里的大多數(shù)元素都能滿足它的需要，不會成為限制性因子。淡水中常缺磷，而海水中常缺氮，氮和磷含量過低常會限制微藻的生長。所以N、P是微藻生長的主要營養(yǎng)鹽。因此，本文對微綠球藻和鹽藻對N和P營養(yǎng)鹽需求的研究，以期為今后為海洋微藻培育過程中營養(yǎng)鹽的研究和微藻生態(tài)調(diào)控防病技術(shù)的研究應(yīng)用提供資料。2.1 藻種：扁藻（Tetraselmis Chui）、鹽藻（Dunaliella salina）2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)2.2.1不同鹽度對微藻生長特性及氮、磷利用的影響實(shí)驗(yàn)所用海水取自近海海域，經(jīng)過棉花粗濾、0.45pm醋酸纖維

4、濾膜過濾，120高溫滅菌20min后使用。自然海水中加入NCaI或蒸餾水，設(shè)置鹽度梯度為10、25、40、55、70，原始海水的鹽度為33。實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基為：NaHCO33.0g/L、NaNO31.0g/L、KH2PO40.025g/L、f/2微量元素lmL、f/2維生素lmL。用250mL的錐形瓶，取處于對數(shù)生長期的藻種接種，置于光照搖床進(jìn)行一次性培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20±1，搖床轉(zhuǎn)速100rpm，光照強(qiáng)度2500-3500lx(1.0mW/cm2=46mmol/(m2S)=25001x)，持續(xù)光照培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每天定時測定藻的光密度OD、細(xì)胞生長速率K，培養(yǎng)結(jié)束后測定藻體中各種生化成分如

5、葉綠素a、多糖、蛋白質(zhì)的積累情況，并測定培養(yǎng)液中硝態(tài)氮和無機(jī)磷的剩余量以考察微藻在不同鹽度下對氮磷的利用情況。2.2.2不同氮、磷濃度對微藻生長特性及氮、磷利用的影響（1）氮濃度比較實(shí)驗(yàn)NaNO3加入量分別設(shè)置為0（無N組）、0.1、0.4、0.8、1.2g/L，其他培養(yǎng)基成分為NaHCO33.0g/L、KH2PO40.025g/L、f/2微量元素lmL、f/2維生素lmL，用250mL的錐形瓶，取處于對數(shù)生長期的藻種接種，置于光照搖床進(jìn)行一次性培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20±1，搖床轉(zhuǎn)速100rpm，光照強(qiáng)度2500-3500lx(1.0mW/cm2=46mmol/(m2S)=25001x)，

6、持續(xù)光照培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每天定時測定藻的光密度OD、細(xì)胞生長速率K，培養(yǎng)結(jié)束后測定藻體中各種生化成分如葉綠素a、多糖、蛋白質(zhì)的積累情況。（2）磷濃度比較實(shí)驗(yàn)KH2PO4加入量分別設(shè)置為0(無P組)、0.015、0.03、0.045、0.06g/L，其他培養(yǎng)基成分為NaHCO33.0g/L、NaNO31.0g/L、f/2微量元素lmL、f/2維生素lmL，同上培養(yǎng)。（3）無氮磷營養(yǎng)鹽實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基成分為NaHCO33.0g/L、f/2微量元素lmL、f/2維生素lmL，同上培養(yǎng)。2.2.3 不同氮磷比對微藻生長特性及氮、磷利用的影響以NaNO3為氮源，加入NaNO3使?jié)舛纫来螢?.05、0.2、0.

7、5、0.8、1.0g/L，以KH2PO4為磷源，加入KH2PO4使?jié)舛纫来螢?.06、0.06、0.04、0.007、0.008g/L，設(shè)置N:P比分別為l:l、4:l、16:l、80:1、160:1，同上培養(yǎng)。2.2.4 不同氮化合態(tài)比例對微藻生長特性及氮、磷利用的影響按總NH4+-N、NO3-N所占比例不同分為5個處理，分別為NH4+-N:NO3N=10:1，3:1，1:1，1:3和1:10，實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基為：NaHCO33.0g/L、NaNO31.0g/L、KH2PO40.025g/L、f/2微量元素lmL、f/2維生素lmL。2.3 指標(biāo)的測定及方法2.3.1 藻體計(jì)數(shù)用三角燒瓶培養(yǎng)高濃度

8、的扁藻、鹽藻藻液（約3000×104cells. mL-1），稀釋成一定的濃度梯度后用分光光度計(jì)(680nm、700nm) 測定光密度值，將藻液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算其細(xì)胞數(shù)，制作工作曲線。培養(yǎng)過程中每天上午定時用分光光度計(jì)（680nm、700nm）測出各錐形瓶中的相應(yīng)的藻細(xì)胞濃度，以不加藻種的相同培養(yǎng)液為空白。2.3.2 細(xì)胞生長速率的測定細(xì)胞生長速率K=(lnX2-lnX1)/T，X2表示T天后的藻密度；X1表示初始藻密度（個/ml）；T表示培養(yǎng)時間。2.3.3 硝態(tài)氮濃度的測定（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作吸取500pm/mL硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液。lmL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL、1

9、2mL分別放入50mL容量瓶中，用無離子水定容至刻度，使之成10m/L、20m/L、40m/L、60m/L 、80m/L、100m/L、120m/L硝態(tài)氮的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液0.lmL，分別放入刻度試管中，以0.lmL無離子水代替標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白。在分別加入0.4mL5%水楊酸-硫酸溶液，搖勻，在室溫下放置20min后，在加入8%NaOH溶液9.5mL，搖勻冷卻至室溫。顯色液總體積10mL。以空白作參比，在410nm波長下測定吸光度。以硝態(tài)氮濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)硝態(tài)氮含量的測定取適量藻液5000rpm離心10min，上清0.lmL分別于3支刻度試管中

10、，然后加入5%水楊酸-硫酸溶液0.4mL，混勻后室溫下20min，在慢慢加入9.smLS%NaH0，待冷卻至室溫后，以空白作參比，在410nul下測定其吸光度。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藻液中硝態(tài)氮的含量。2.3.4 多糖的測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：精密稱取分析純葡萄糖0.1g，加少量蒸餾水溶解，移至1000mL容量瓶定容至刻度，得0.lmg/mL葡萄糖溶液。取0.1mg/mL葡萄糖溶液0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90(mL)，用蒸餾水補(bǔ)充到1.00mL，分別加入4.00mL蒽銅試劑，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加蓋以防蒸發(fā)。自水浴重新煮沸起，準(zhǔn)確煮沸10min取出，用自來水冷卻，室溫放置10min左右，測OD620值。以同樣方法處理重蒸蒸餾水為空白對照，進(jìn)行比色。以光密度值為縱坐標(biāo)，糖含量的微克數(shù)為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。取適量體積藻液，5000prm下離心10min，上清藻液待測胞外多糖，藻泥加入等體積PBS緩沖液，凍融破碎3次，充分振蕩后，5000prm離心10min，各取1mL于4mL蒽銅中，沸水浴中煮沸10min，自來水冷卻至室溫，620nm比色，根據(jù)葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到胞內(nèi)外多糖含量。實(shí)驗(yàn)中PBS緩沖液為8.5953gNaH2P04與0.9361gNa2HP04于500mL棕色容量瓶，去離