兩種氟喹諾酮類藥物對肺炎克雷伯菌防耐藥突變濃度及耐藥突變體耐

1、兩種氟喹諾酮類藥物對肺炎克雷伯菌防耐藥突變濃度及耐藥突變體耐藥性的研究         09-08-27 09:33:00     編輯：studa20                    作者：鄧曉慧 鄭風(fēng)勁 何文富 孫愛慧 劉小康【摘要】  目的 測定兩種氟喹諾酮

2、類藥物(FQNs)對肺炎克雷伯菌(KP)的防耐藥突變濃度(MPC)，比較其防耐藥突變能力，了解突變耐藥菌對FQNs的耐藥性。方法 肉湯法富集1010CFU/ml的菌液接種于不同濃度環(huán)丙沙星及加替沙星瓊脂平皿上，采用瓊脂二倍稀釋法測定環(huán)丙沙星、加替沙星對臨床分離肺炎克雷伯菌ATCC700603及其耐藥突變體的最低抑菌濃度(MIC)、防耐藥突變濃度(MPC)。對不同藥物濃度篩選出的耐藥突變株進(jìn)行編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶VIC亞單位基因parC和回旋酶A亞單位基因gyrA喹諾酮耐藥決定區(qū)的PCR擴(kuò)增和測序，并測定外排泵抑制劑羥基氰氯苯腙(Carbonyl Cyanide mchlorophenylhydraz

3、one，CCCP)對環(huán)丙沙星和加替沙星MIC的影響。結(jié)果 環(huán)丙沙星、加替沙星對ATCC700603的MPC分別為4、1.6mg/L，細(xì)菌耐藥選擇指數(shù)分別為16、4。兩種藥物的耐藥突變體均出現(xiàn)了gyrA的第83位(TCCATC/TTG)均出現(xiàn)了突變，引起了相應(yīng)氨基酸的改變(Ser83Ile/Leu)。其中有一株同時也出現(xiàn)了第87位點(diǎn)(GACAAC)的改變，氨基酸也由AspAsn。除第二步突變體parC第80位點(diǎn)突變(AGCATC)，引起氨基酸由SerIle的改變外，其余幾株均沒有發(fā)生parC的突變。MIC測定結(jié)果顯示，單用兩種FQNs及合用CCCP的結(jié)果一樣。結(jié)論 加替沙星限制KP耐藥突變株選擇

4、的能力強(qiáng)于環(huán)丙沙星，KP的耐藥突變株對FQNs耐藥的主要原因是gyrA和parC基因突變。 【關(guān)鍵詞】  氟喹諾酮； 肺炎克雷伯菌； 耐藥； 防耐藥突變濃度    ABSTRACT  Objective  To determine mutant prevention concentration (MPC) of two fluoroquinolones for Klebsiella pneumoniae (KP) and compare the capacity of fluoroquinolones to prevent the r

5、esistant mutant strains.  Methods  The KP strain ATCC700603 was enriched in broth, and the bacterial concentrations were adjusted to 1010 colony forming units per milliliter. The minimal inhibitory concentration (MIC) and MPC of gatifloxacin and ciprofloxacin for KP were determined by agar

6、 plates dilution method. Quinolone resistancedeternining region (QRDR) of parC and gyrA genes were identified by PCR amplification and gene sequencing. The effect of effluxpump inhibitor CCCP on MICs of gatifloxacin and ciprofloxacin for resistant mutants was determided by agar dilution method. 

7、; Results  The MPC of gatifloxacin and ciprofloxacin for KP strain ATCC700603 were 1.6 and 4mg/L, and the MPC/MIC were 4 and 16 respectively. The all strains had an TCCATC or TCCTTG mutation in codon 83, leading to amino acid change: SerLeu or SerIle. At the same time, a GACAAC mutation was fou

8、nd in codon 87 which resulted in amino acid change: AspAsn. Except for the secondstep mutant, DNA sequencing analysis of parC did not reveal point mutation (AGCATC) leading the substitution of a Ile for Ser in 4 strains. As for the MICs, of which the two fluoroquinolones withCCCP were same as the MI

9、Cs without CCCP.  Conclusions  The capacity of gatifloxacin for restricting the selection of KP resistant mutants is stronger than that of ciprofloxacin. The mutation of gyrA and parC genes are the primary mechanisms responsing for resistance of Klebsiela pneumoniae to FQNs.  

10、60; KEY WORDS  Fluoroquinolones;  Klebsiella pneunoniae;  Drug resistance;  Mutant prevention concentration    肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneunoniae，KP)是兼性厭氧的革蘭陰性菌，通常存在于人類腸道及呼吸道，是目前重要的條件致病菌，其發(fā)病率1僅次于大腸埃希菌和銅綠假單胞菌。氟喹諾酮類藥物(FQNs)是治療KP感染的常用藥，由于其廣泛應(yīng)用，KP對其耐藥性逐年遞增。目前，就新一代FQNs的耐藥性及延長

11、其臨床使用壽命，國外學(xué)者Drlica提出了防耐藥突變濃度(mutant prevention concentration，MPC)這一概念2，該理論在關(guān)注抗菌藥物預(yù)防細(xì)菌耐藥變異的同時，對臨床醫(yī)師的用藥也起到了重要的作用。關(guān)于MPC的研究國內(nèi)已經(jīng)開始，但尚未見對KP的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)測定了環(huán)丙沙星(CPLX)和加替沙星(GTLX)對KP的防耐藥突變濃度及耐藥突變株對二者的敏感性，以期為臨床合理應(yīng)用FQNs藥物提供參考。    1  材料    1.1  菌株    受試菌15株，肺炎克雷伯

12、菌ATCC700603(本實(shí)驗(yàn)室保存)，14株臨床分離菌分別來自華西一附院、四川省二院、宜賓市第一人民醫(yī)院2006年6月8月臨床分離的對環(huán)丙沙星敏感菌。    1.2  抗菌藥物    環(huán)丙沙星(CPLX廣州南新制藥有限公司，批號CFI02706)、加替沙星(GTLX浙江亞太藥業(yè)股份有限公司，批號060206)和羥基氰氯苯腙(Carbonyl Cyanide mchlorophenylhydrazone，CCCP，美國Sigma公司)。    1.3  試劑及儀器  

13、;  MullerHinton(MH)肉湯、MH瓊脂、LB肉湯(杭州天和微生物試劑有限公司)。Taq酶和dNTP(大連寶生物工程有限公司)；DNA純化試劑盒(北京天為時代)；SDS、EDTA、飽和酚、氯仿、Tris、EB、瓊脂糖(博瑞克生物科技有限公司)、高速臺式離心機(jī)(美國Sigma公司)、DYY6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠)、PCR擴(kuò)增議(eppendorf)、凝膠成像議(冷泉港生物科技有限公司)。    2  方法    2.1  MIC測定及兩種FQNs藥物聯(lián)合CCCP對耐藥突變株的MI

14、C測定    參照文獻(xiàn)3推薦的瓊脂二倍稀釋法測定CPLX和GTLX對臨床分離KP、ATCC700603及不同耐藥突變株的MIC，在測定MIC的同時，制備含有泵抑制劑CCCP的平板(CCCP終濃度為20mg/L)，與CCCP聯(lián)用的FQNs的MIC比單用FQNs的MIC降低4倍說明有主動外排機(jī)制存在，用大腸埃希S菌ATCC25922作為質(zhì)控菌。判斷按照參考文獻(xiàn)3標(biāo)準(zhǔn)。    2.2  防耐藥突變濃度(MPC)的測定    將CPLX和GTLX倍比稀釋成不同的濃度，藥液和MH瓊脂培養(yǎng)基按19的比例在9

15、0mm的平板中混勻，配制成濃度高于MIC的系列濃度二倍稀釋的含藥平板，每個濃度4個平板，置37孵箱過夜。菌液制備參照文獻(xiàn)Zhao4的方法，單個菌落過夜培養(yǎng)后集菌，把菌液調(diào)至1010CFU/ml，取100l均勻地涂在制備好的含藥平板上，孵育24、48和72h后觀察結(jié)果，以不出現(xiàn)細(xì)菌生長的最低藥物濃度為該藥對這種細(xì)菌的MPC值。    2.3  菌落恢復(fù)生長比率曲線的繪制    按照2.2集菌方法集菌后，將1010CFU/ml的菌液倍比稀釋成不同濃度至103CFU/ml，將不同濃度菌液100l涂在含抗菌藥物平板上，計(jì)數(shù)恢復(fù)生長菌

16、落數(shù)及恢復(fù)生長比率，描繪生長比率曲線。    2.4  GTLX和CPLX對ATCC700603耐藥突變株的選擇及其基因組DNA的提取    按照上述2.2方法集菌后，將100l的菌液接種于含2MICMPC不同濃度的抗菌藥物平皿上，37培養(yǎng)4872h，挑取不同濃度平板上生長的菌落，將這些菌落培養(yǎng)2代后接種于原藥物濃度的平板上如仍然生長即為耐藥突變株，1、2步耐藥突變株均按照此方法選擇。篩選出的耐藥突變株用堿裂解法提取基因組DNA，做為PCR的DNA模板。    2.5  耐藥突變株gyrA基因和parC基因的擴(kuò)增及測序    使用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，gyrA正向引物為5TGCGAGAGAAATTACACC3，反向引物為5AATATG