基因表達譜芯片篩選強直性脊柱炎差異表達基因的-第三軍醫(yī)大學學報(共5頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上基因表達譜芯片篩選強直性脊柱炎差異表達基因的研究張 瑩，初同偉（重慶，第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院骨科）摘要目的 應用表達譜芯片比較人強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）組織與正常骶髂關(guān)節(jié)組織的基因表達差異，篩選AS疾病相關(guān)基因。方法 分別提取AS與正常簡要添加病例來源，包括有：醫(yī)院、科室、例數(shù)、診斷、性別、平均年齡（中位年齡）、入選時間段等骶髂關(guān)節(jié)的滑膜組織與椎旁組織的RNA，制備探針后用于表達譜芯片雜交，篩選AS組織差異表達基因，并采用半定量RT-PCR法驗證芯片結(jié)果。結(jié)果 與正常組織樣本相比，在AS組織中篩選獲得差異表達基因237條，表達上

2、調(diào)的已知基因91條，表達下調(diào)的已知基因78條；對其中20條基因進行半定量RT-PCR檢測，結(jié)果與表達譜芯片結(jié)果一致。結(jié)論這類似一個技術(shù)方法的結(jié)論 利用表達譜芯片技術(shù)初步篩選出與AS相關(guān)的多個差異表達基因，為揭示AS的具體機制提供依據(jù)。關(guān)鍵詞強直性脊柱炎；基因表達譜芯片；差異表達基因Screening differentially expressed genes in ankylosing spondylitis by cDNA microarrayZHANG Ying，CHU Tongwei（Department of Orthopedics， Xinqiao Hospital， Third

3、Military Medical University， Chongqing ，China）Abstract Objective To detect the differentially expressed genes between ankylosing spondylitis(AS) and normal tissues， and screen AS-associated genes via cDNA microarrays. Methods Total RNA was isolated from synovium and paravertebral tissues of both AS

4、and normal sacroiliac joint， and used to construct hybridization probes. The probes were hybridized to the cDNA microarrays， and then the differentially expressed genes of AS were identified. Finally， semi-quantitative RT-PCR were applied to confirm the results of cDNA microarrays. Results 237 diffe

5、rentially expressed genes were detected from AS group with normal tissue as a reference， including 91 up-regulated kown genes and 78 down-regulated kown genes. semi-quantitative RT-PCR revealed the expression pattern of 20 candidate differentially expressed genes were consistented with the results o

6、f cDNA microarrays. Conclusion A number of AS-associated differentially expressed genes were detected via cDNA microarrays， and the present study will helpful to unveil the molecular mechanisms of ankylosing spondylitis.Key words ankylosing spondylitis； cDNA microarray； differentially expressed gene

7、sSupported by the National Natural Science Foundation of China()，Corresponding author：name？Tel：86- - ？；E-mail？基金項目 國家自然科學基金資助項目（）通訊作者初同偉，電話：(023) ，E-mail：chtwsina. com強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS) 是一種主要累及脊椎等中軸關(guān)節(jié)和肌腱、韌帶骨附著點的慢性炎性疾病1，可引起脊柱骨性強直甚至中軸關(guān)節(jié)的活動功能喪失，導致嚴重的殘疾。AS在中國人群中的發(fā)病率約為0.2%，患者多為青壯年，給患者及家庭帶來

8、沉重負擔2?，F(xiàn)有AS療法多為對“癥”治療，難以取得滿意的療效；要實現(xiàn)對“因”治療，需要明確AS的具體發(fā)病機制。文獻報道不同人群和種族的AS患者都表現(xiàn)出與HLA-B27（human leukocyte antigen B27）的強相關(guān)性3，AS患者的 HLA-B27陽性率高達90%。但據(jù)統(tǒng)計B27陽性者的AS發(fā)病率不到5%，說明有B27以外的因素與發(fā)病有關(guān)4。還有學者認為AS 與細菌感染有關(guān)5，但至今未能在病變部位找到感染原，無法證實該觀點。另有觀點認為HLA-B27分子的錯誤折疊可能引發(fā)機體的自身免疫應答6，導致AS的發(fā)生?？勺鳛橛懻搩?nèi)容最近研究發(fā)現(xiàn)在活動期AS患者體內(nèi)巨噬細胞集落刺激因子持續(xù)

9、高表達，脊柱關(guān)節(jié)內(nèi)有T細胞浸潤，表明免疫細胞參與了AS的發(fā)病過程7。不同的研究報道表明AS有多種致病因素，但其具體分子機制尚不清楚。本研究擬采用表達譜芯片技術(shù)，研究AS組織的基因表達譜變化，篩選AS相關(guān)差異表達基因，為解析AS發(fā)病的分子機制和開展治療提供參考。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 標本獲得 選取本科室從2010年1月至8月收治的AS患者3例為試驗組，男性2例，女性1例，平均年齡30.2歲，均為活動期（有炎性腰背痛，X骨盆平片提示：骶髂關(guān)節(jié)有明顯骨化線，C-反應蛋白、ESR水平升高，HLA-B27陽性），符合1984年美國風濕病協(xié)會修訂的紐約標準。選取本科室從2010年3月收治的

10、脊柱骨折患者1例為對照組，男性，年齡32歲。試驗組脊柱韌帶和滑膜組織自關(guān)節(jié)置換術(shù)中取得，對照組脊柱韌帶和滑膜組織自骨折切開復位術(shù)中取得。取樣后用生理鹽水迅速洗凈組織表面，液氮保存。本實驗采用程序嚴格遵循本院人體試驗委員會制定的倫理學標準，同時獲得該委員會批準，并征得全部患者的知情同意。1.1.2芯片和主要試劑 人基因表達譜芯片GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array購自Affymetrix公司，含47000個轉(zhuǎn)錄本和變異體，其中包括約39000個已知基因和6500個新基因。RNA提取試劑Plant RNAout購自Tiandz公司；One-step R

11、NA PCR Kit購自Takara公司；RNeasy Micro Kit購自Qiagen公司；one-cycle cDNA Synthesis Kit、Sample Cleanup Module、IVT Labeling Kit、Gengchip Hybridization，Wash and Strain Kit購自Affymetrix公司；引物由Invitrogen公司合成。1.2 方法1.2.1 RNA提取 脊柱韌帶和滑膜組織中含有大量的蛋白和多糖，尤其是多糖對分離RNA影響極大。采用常規(guī)動物組織RNA提取方法，難以獲得高質(zhì)量的總RNA。本實驗采用提取植物組織總RNA的Plant RNA

12、out試劑提取標本RNA，試劑盒基于改良CTAB法構(gòu)建，可有效去除多糖。這類文字不適合出現(xiàn)在“方法”當中，可以放進“討論”當中，請就事論事。實驗按試劑說明書操作，實驗流程作如下調(diào)整：組織塊進行液氮研磨后，混合提取緩沖液轉(zhuǎn)移到勻漿器中勻漿；勻漿產(chǎn)物進行兩次氯仿抽提，加大離心轉(zhuǎn)數(shù)、延長離心時間以去凈沉淀；RNA沉淀用75%乙醇洗滌兩次。1.2.2 探針制備及雜交 采用RNeasy Micro Kit純化總RNA。采用one-cycle cDNA Synthesis Kit將純化獲得的mRNA合成為雙鏈cDNA，并采用Sample Cleanup Module進行純化。純化的雙鏈cDNA用IVT L

13、abeling Kit合成cRNA。按照Gengchip Hybridization，Wash and Strain Kit進行雜交：首先將cRNA進行片段化，作為探針與芯片進行雜交（AS試驗組進行3個生物學重復），最后依次洗脫芯片并染色。1.2.3數(shù)據(jù)分析 芯片掃描采用Affymetrix專用的Gene array Scanner 3000進行，應用GCOS軟件進行數(shù)據(jù)分析。比較AS試驗組與對照組芯片結(jié)果前，先將芯片所有探針組的信號進行“Normalize”處理，處理后的數(shù)據(jù)用于計算SLR值（signal log ratio，試驗組與對照組取log2后的比值）。差異表達基因篩選嚴格按照如下標

14、準：上調(diào)組SLR1（對應的比值為2），下調(diào)組SLR1（對應的比值為0.5）。1.2.4 RT-PCR驗證芯片結(jié)果 根據(jù)芯片分析結(jié)果，選取差異表達基因并設(shè)計引物。以對照組和AS試驗組總RNA為模板，按照one-step RNA PCR Kit方法對芯片篩選結(jié)果進行RT-PCR驗證，實驗重復3次。PCR產(chǎn)物電泳后進行灰度掃描并統(tǒng)計。2 結(jié)果2.1 RNA電泳及純度檢測樣品RNA的D（260）/D（280）方法中未見介紹比值均在2.0左右，純度高。經(jīng)瓊脂糖電泳可見清晰的28s、18s及5s條帶（圖1），完整性較好，符合芯片檢測要求。 1 2 3 428s18s5s1：對照組；2： ；3： ；4： 圖

15、1 RNA電泳結(jié)果2.2 芯片分析結(jié)果按照設(shè)定的差異表達基因篩選標準，從3組芯片雜交結(jié)果篩選出在AS組織中的共同差異表達基因237條，其中明確基因功能的基因169條，功能不明確的序列68條。169條已知基因中，表達上調(diào)的91條(表1)，表達下調(diào)的78條(表2)。表1 AS組織中表達上調(diào)的部分基因題目缺乏自明性，必須兼?zhèn)鋵嶒瀸ο?、實驗條件、時相點、結(jié)果效應等基本因素，采用定語+主語或主語+謂語的語法形式，請重擬基因基因全稱SLR 中英文全稱？CRPC-reaction protein2.2TNF-tumor necrosis factor alpha2.1IL-1interleukin 11.3

16、IL-6interleukin 62.0BMP-2bone marphogenic protein 22.4VEGFvascular endothelial growth factor1.7bFGFbasic fibroblast growth factor1.4Cbfa1core binding factor l2.2MMP3matrix metalloprotelnase 31.6HIF1hypoxia inducible factor 1 alpha1.8表2 AS組織中表達下調(diào)的部分基因題目缺乏自明性，必須兼?zhèn)鋵嶒瀸ο?、實驗條件、時相點、結(jié)果效應等基本因素，采用定語+主語或主語+謂語的

17、語法形式，請重擬基因基因全稱SLR中英文全稱？ HBDhemoglobin， delta-1.6IGF-1insulin-like growth factors 1-1.7sTNFRsoluble tumor necrosis factor receptor-1.4IL-Rainterleukin-1 receptor antagonist-1.0CBcalgranulin B-1.8PDGFplatelet-derived growth factor-1.2CTGFconnective tissue growth factor-1.8FNfibronectin-3.0Collagen Ity

18、pe I collagen-2.6Collagen IItype II collagen-2.32.3 芯片結(jié)果的半定量RT-PCR驗證從Genbank檢索表1和表2中列出的20條基因序列，設(shè)計引物進行半定量RT-PCR檢測。檢測結(jié)果表明，待測基因上調(diào)或下調(diào)趨勢與芯片結(jié)果吻合，如圖2。ABCRP TNF-IL-1IL-6 BMP-2VEGFbFGFCbfa1MMP3HIF1b-actinControl AS分別標注bp大小1、 圖片橫縱座標標目請用中文標注完整，注意添加量符號和單位；2、 圖片中數(shù)據(jù)的標注方式是“±s”的形式么？3、 圖C、D修改同此。CDHBD IGF-1sTNFR

19、IL-Ra CBPDGFCTGFFNcollagen Icollagen IIb-actinControl ASA：AS組織中表達上調(diào)的基因；B：上調(diào)基因的灰度掃描統(tǒng)計；C：AS組織中表達下調(diào)的基因；D：下調(diào)基因的灰度掃描統(tǒng)計圖2 差異表達基因的半定量RT-PCR檢測題目缺乏自明性，必須兼?zhèn)鋵嶒瀸ο?、實驗條件、時相點、結(jié)果效應等基本因素，采用定語+主語或主語+謂語的語法形式，請重擬3 討論本研究采用的表達譜芯片涵蓋信息量豐富的人基因組轉(zhuǎn)錄本信息，可以對差異表達基因進行高通量篩選。由于基因表達的個體差異，單個樣本雜交的結(jié)果假陽性率較高，不利于對芯片結(jié)果進行科學判斷。本研究采用3個不同的活動期AS

20、標本，最后選取在3個樣本中均有明顯差異表達的基因進行RT-PCR驗證以進一步排除假陽性，結(jié)果可靠，因此對后續(xù)研究有較大參考價值。AS組織中表達上調(diào)的91條已知基因中，我們認為與AS相關(guān)的主要有3類：炎癥免疫相關(guān)、關(guān)節(jié)骨化相關(guān)及代謝相關(guān)的基因。我們檢測到多個炎癥因子如TNF-、IL-1、IL-6等的高表達，這與標本組織特性一致：實驗組樣本取自活動期AS患者，屬高炎性免疫活性組織，必然有多種炎癥因子的高表達。TNF-是重要的早期炎癥因子，可誘導其它炎癥因子如IL-1、IL-6的表達，激活多種炎性反應。Brown等3報道在AS患者骶髂關(guān)節(jié)檢測到TNF- 表達明顯上調(diào)。目前臨床上采用拮抗TNF-策略開

21、展AS治療，可顯著降低患者CRP、MMP3、VEGF水平，緩解患者的炎性疼痛。IL-1、IL-6也是重要的炎癥因子，與類風濕關(guān)節(jié)炎、AS等疾病密切相關(guān)8。芯片結(jié)果還顯示AS組織中VEGF、BMP-2、bFGF、Cbfa1等成骨基因的高表達。VEGF可特異性促進血管內(nèi)皮細胞增生和血管生成，而骨化初期必伴有血管生成，本室已報道VEGF有明顯成骨作用9。BMP-2是唯一可單獨誘導成骨的因子，具有強大的成骨作用10。bFGF具有促進成骨細胞增殖作用，同時也是與骨化密切相關(guān)的毛細血管增殖刺激因子11。Cbfal是成骨分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，具有明確的成骨效應12。由于AS發(fā)病的最終結(jié)果為中軸關(guān)節(jié)的骨性融合，

22、我們認為可導致中軸關(guān)節(jié)骨化的上述成骨基因與AS發(fā)病密切相關(guān)。AS組織表達下調(diào)的78條已知基因，我們認為AS相關(guān)基因有4類：炎癥因子拮抗劑、軟骨組成蛋白、軟骨生長因子及代謝相關(guān)的基因。sTNFR和IL-Ra分別是TNF和IL-1的拮抗劑，可以中和炎癥因子對椎間、椎旁組織的刺激和破壞作用13。CB、FN、I/ II型膠原均為軟骨細胞和基質(zhì)的重要組成蛋白，其低表達導致軟骨細胞、基質(zhì)的形態(tài)難以維持，同時AS組織中MMP3的高表達（表1）也能促使軟骨基質(zhì)降解14，上述基因的表達變化可能參與了椎間軟骨骨化過程。芯片結(jié)果還顯示IGF-1、PDGF、CTGF等3個生長因子表達顯著降低。IGF-1和CTGF均具

23、有促進軟骨細胞增殖、調(diào)節(jié)其分泌膠原和蛋白多糖的作用15，PDGF則具有促進軟骨細胞分裂增殖、脫鈣形成軟骨作用16。3個與軟骨細胞增殖發(fā)育相關(guān)的生長因子的低表達可能也與AS發(fā)病中椎間軟骨骨化和脊柱融合有關(guān)。芯片結(jié)果還顯示AS組織中氧代謝相關(guān)基因的表達發(fā)生變化：血氧蛋白HBD基因表達下調(diào)和低氧誘導因子HIF1基因表達上調(diào)。我們認為HBD表達下調(diào)導致AS組織中氧分壓較低，而AS組織的低氧狀態(tài)誘導了低氧誘導因子HIF1的高表達。Cramer等17報道生長板軟骨細胞在低氧條件下激活HIF1表達，從而誘導VEGF的表達，抑制HIF1表達可完全阻止低氧誘導的軟骨細胞表達VEGF。HIF1是VEGF在低氧條件

24、下表達的重要條件，因此我們認為HIF1及HBD在AS發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用?？傊?，本研究應用基因表達譜芯片獲得了AS基因表達譜，篩選到237條差異表達基因，顯示AS組織中大量基因的表達發(fā)生變化，表明可能有多個基因參與了AS發(fā)病過程。對差異表達基因特別是未知基因進行深入探討，將有助于從分子水平理解AS的病理生理過程，為最終解析AS的發(fā)病機制提供依據(jù)。參考文獻：4、1、 參考文獻陳舊，注意太過陳舊的參考文獻不宜引用。引用近35年的文獻在80%以上，請更換或刪減；2、 修改后的參考文獻不能少于15篇；3、 請盡量查閱引用本刊2008、2009年的文獻；4、 部分文獻缺漏期號，作者姓名錄入有誤； 5、

25、 請按照文獻后邊提示的正規(guī)格式核實補充文獻。 1 Kim T H，Uhm W S，Inman R D. Pathogenesis of ankylosing spondylitis and reactive arthritis J. Curr Opin Rheumatol，2005， 17(4): 400- 5.2 顧鳴敏，袁文濤，楊玨琴，等. 全基因組掃描尋找強直性脊柱炎的易感基因位點J.遺傳學報. 2004， 31(3): 217- 20.3 Brown MA， Crane AM， Wordsworth BP. Genetic aspects of susceptibility， seve

26、rity， and clinical expression in ankylosing spondylitis J. Curr Opin Rheumatol， 2002， 14(4 ): 354- 60.4 Reveille JD. The genetic basis of ankylosing spondylitis J. Curr Opin Rheumatol， 2006， 18(4): 332- 41. 5 Rehakova Z， Capkova J， Stepankova R， et al. Germ-free mice do not develop ankylosing enthes

27、opathy， a spontaneous joint disease J. Hum Immunol， 2000， 61(6): 555- 8.6 Reveille JD. Major histocompatibility genes and ankylosing spondylitis J. Best Pract Res Clin Rheumatol， 2006， 20(3): 601- 9.7 Appel H， Kuhne M， Spiekermann S， et al. Immunohistologic analysis of zygapophyseal joints in patien

28、ts with ankylosing spondylitis J. Arthritis Rheum， 2006， 54(9): 2845- 51.8 Sawada T， Hirohata S， Inoue T， et al. Correlation between rheumatoid factor and IL-6 activity in synovial fluids from patients with rheumatoid arthritis J. Clin Exp Rheumatol， 1991， 9(4): 363- 8.9 初同偉，王正國，朱佩芳，等. 血管內(nèi)皮生長因子在骨折愈合

29、中的作用J.中國修復重建外科雜志，2002， 16(2): 75- 78.10 Wozney JM， Rosen V. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair J. Clin Orthop Relat Res， 1998， 346: 26- 37.11 Yeung HY， Lee SK， Fung KP， et al. Expression of basic fibroblast growth factor during distract

30、ion osteogenesis J. Clin Orthop Relat Res， 2001， 385: 219- 29.12 Ducy P， Starbuck M， Priemel M， et al. Cbfa1-dependent genetic pathway controls bone formation beyond embryonic development J. Genes Dev， 1999， 13(8): 1025- 36.13 Evans CH， Ghivizzani SC， Herndon JH， et al. Gene therapy for the treatment of musculoskeletal diseases J. J A