第一代基因測(cè)序

1、第一代第一代DNA序列測(cè)定序列測(cè)定DNA測(cè)序技術(shù)的誕生和發(fā)展1980年，Sanger和Gilbert 因建立DNA測(cè)序技術(shù)而獲得諾 貝爾化學(xué)獎(jiǎng)（Sanger是第2次獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) ）。v1977年，美國(guó)哈佛大學(xué)生化學(xué)家Walter Gilbert發(fā)明DNA化學(xué)降解法測(cè)序技術(shù)(Maxam 和Gilbert,1977)。v1977年，英國(guó)劍橋醫(yī)學(xué)研究會(huì)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室Frederick Sanger 發(fā)明雙脫氧鏈終止法DNA測(cè)序技術(shù)(Sanger和Coulson)。DNA測(cè)序技術(shù)的誕生（第一代測(cè)序技術(shù)的誕生（第一代DNA測(cè)序技術(shù)）測(cè)序技術(shù)）1.1 化學(xué)降解法 在該方法中，一個(gè)末端被放射性標(biāo)記的

2、DNA片段在5組互相獨(dú)立的化學(xué)反應(yīng)中分別被部分降解，其中每一組反應(yīng)特異地針對(duì)某種堿基。因此生成 5 組放射性標(biāo)記的分子，每組混合物中均含有長(zhǎng)短不一的 DNA分子，其長(zhǎng)度取決于該組反應(yīng)所針對(duì)的堿基在原 DNA片段上的位置。最后，各組混合物通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，再通過(guò)放射自顯影來(lái)檢測(cè)末端標(biāo)記的分子。1.1 化學(xué)降解法 準(zhǔn)確性較好，易掌握，因此用得較多。且所測(cè)序列來(lái)自DNA分子而不是酶促合成產(chǎn)生的拷貝，排除了合成時(shí)造成的錯(cuò)誤。但化學(xué)降解法操作過(guò)程較麻煩，逐漸被簡(jiǎn)便快速的 Sanger法所代替。雙脫氧法雙脫氧法(Dudeoxy sequence analyses)雙脫氧法又稱(chēng)末端終止法，用于

3、單鏈測(cè)序雙脫氧法又稱(chēng)末端終止法，用于單鏈測(cè)序19197777年年Sanger Sanger 利用此原理建立了雙脫氧測(cè)序法利用此原理建立了雙脫氧測(cè)序法原理原理：與：與加減法相似，但不再是加一種加減法相似，但不再是加一種dNTPdNTP或減一種或減一種dNTP,dNTP,而是加入某一種雙脫氧核苷，來(lái)終止聚合反應(yīng)。而是加入某一種雙脫氧核苷，來(lái)終止聚合反應(yīng)。1.2 雙脫氧鏈終止法 Sanger Sanger法：簡(jiǎn)便、快速，經(jīng)過(guò)后續(xù)的不斷改法：簡(jiǎn)便、快速，經(jīng)過(guò)后續(xù)的不斷改良，成為了迄今為止良，成為了迄今為止DNADNA測(cè)序的主流。測(cè)序的主流。1.2 雙脫氧鏈終止法1.3 熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù) 熒光自動(dòng)測(cè)序技

4、術(shù)基于 Sanger原理，用熒光標(biāo)記代替同位素標(biāo)記，并用成像系統(tǒng)自動(dòng)檢測(cè) ，從而大大提高了DNA測(cè)序的速度和準(zhǔn)確性。1.4 雜交測(cè)序技術(shù) 雜交法測(cè)序是 20世紀(jì) 80年代末出現(xiàn)的一種測(cè)序方法，是利用DNA雜交原理，將一系列已知序列的單鏈寡核苷酸片段固定在基片上，把待測(cè)的 DNA樣品片段變性后與其雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。 檢測(cè)速度快，成本低，具有部分第二代測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)。但該方法誤差較大，且不能重復(fù)測(cè)定。雙脫氧鏈終止法 雙脫氧鏈終止法又稱(chēng)為 Sanger法，該方法的原理是：核酸模板在 DNA聚合酶、引物、4種單脫氧核苷三磷酸 (dNTP,其中的一種用放射性 P32標(biāo)記 ) 存在條

5、件下復(fù)制時(shí),在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入4種雙脫氧核苷三磷酸 (ddNTP)，因?yàn)殡p脫氧核苷沒(méi)有 3-OH，所以只要雙脫氧核苷摻入鏈的末端,該鏈就停止延長(zhǎng) 。雙脫氧鏈終止法 如此每管反應(yīng)體系中便合成以各自的雙脫氧堿基為 3端的一系列長(zhǎng)度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后，分 4個(gè)泳道進(jìn)行凝膠電泳， 分離長(zhǎng)短不一的核酸片段 ，長(zhǎng)度相鄰的片段相差一個(gè)堿基。經(jīng)過(guò)放射自顯影后，根據(jù)片段 3端的雙脫氧核苷，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法Seq雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法測(cè)序峰圖雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法意義 快速和準(zhǔn)確地獲取生物體的遺傳信息對(duì)于生命科快速和準(zhǔn)確地獲取生物體的遺傳信息對(duì)于生命科學(xué)研究一直具有十分重要的意義。對(duì)于每個(gè)生物體來(lái)學(xué)研究一直具有十分重要的意義。對(duì)于每個(gè)生物體來(lái)說(shuō)，基因組包含了整個(gè)生物體的遺傳信息。測(cè)序技術(shù)說(shuō)，基因組包含了整個(gè)生物體的遺傳信息。測(cè)序技術(shù)能夠真實(shí)地反映基因組能夠真實(shí)地反映基因組DNADNA上的遺傳信息，進(jìn)而比較上的遺傳信息