第一代基因測序

1、第一代第一代DNA序列測定序列測定DNA測序技術(shù)的誕生和發(fā)展1980年，Sanger和Gilbert 因建立DNA測序技術(shù)而獲得諾 貝爾化學(xué)獎（Sanger是第2次獲得諾貝爾化學(xué)獎 ）。v1977年，美國哈佛大學(xué)生化學(xué)家Walter Gilbert發(fā)明DNA化學(xué)降解法測序技術(shù)(Maxam 和Gilbert,1977)。v1977年，英國劍橋醫(yī)學(xué)研究會的分子生物學(xué)實驗室Frederick Sanger 發(fā)明雙脫氧鏈終止法DNA測序技術(shù)(Sanger和Coulson)。DNA測序技術(shù)的誕生（第一代測序技術(shù)的誕生（第一代DNA測序技術(shù)）測序技術(shù)）1.1 化學(xué)降解法 在該方法中，一個末端被放射性標記的

2、DNA片段在5組互相獨立的化學(xué)反應(yīng)中分別被部分降解，其中每一組反應(yīng)特異地針對某種堿基。因此生成 5 組放射性標記的分子，每組混合物中均含有長短不一的 DNA分子，其長度取決于該組反應(yīng)所針對的堿基在原 DNA片段上的位置。最后，各組混合物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，再通過放射自顯影來檢測末端標記的分子。1.1 化學(xué)降解法 準確性較好，易掌握，因此用得較多。且所測序列來自DNA分子而不是酶促合成產(chǎn)生的拷貝，排除了合成時造成的錯誤。但化學(xué)降解法操作過程較麻煩，逐漸被簡便快速的 Sanger法所代替。雙脫氧法雙脫氧法(Dudeoxy sequence analyses)雙脫氧法又稱末端終止法，用于

3、單鏈測序雙脫氧法又稱末端終止法，用于單鏈測序19197777年年Sanger Sanger 利用此原理建立了雙脫氧測序法利用此原理建立了雙脫氧測序法原理原理：與：與加減法相似，但不再是加一種加減法相似，但不再是加一種dNTPdNTP或減一種或減一種dNTP,dNTP,而是加入某一種雙脫氧核苷，來終止聚合反應(yīng)。而是加入某一種雙脫氧核苷，來終止聚合反應(yīng)。1.2 雙脫氧鏈終止法 Sanger Sanger法：簡便、快速，經(jīng)過后續(xù)的不斷改法：簡便、快速，經(jīng)過后續(xù)的不斷改良，成為了迄今為止良，成為了迄今為止DNADNA測序的主流。測序的主流。1.2 雙脫氧鏈終止法1.3 熒光自動測序技術(shù) 熒光自動測序技

4、術(shù)基于 Sanger原理，用熒光標記代替同位素標記，并用成像系統(tǒng)自動檢測 ，從而大大提高了DNA測序的速度和準確性。1.4 雜交測序技術(shù) 雜交法測序是 20世紀 80年代末出現(xiàn)的一種測序方法，是利用DNA雜交原理，將一系列已知序列的單鏈寡核苷酸片段固定在基片上，把待測的 DNA樣品片段變性后與其雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。 檢測速度快，成本低，具有部分第二代測序技術(shù)的特點。但該方法誤差較大，且不能重復(fù)測定。雙脫氧鏈終止法 雙脫氧鏈終止法又稱為 Sanger法，該方法的原理是：核酸模板在 DNA聚合酶、引物、4種單脫氧核苷三磷酸 (dNTP,其中的一種用放射性 P32標記 ) 存在條

5、件下復(fù)制時,在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入4種雙脫氧核苷三磷酸 (ddNTP)，因為雙脫氧核苷沒有 3-OH，所以只要雙脫氧核苷摻入鏈的末端,該鏈就停止延長 。雙脫氧鏈終止法 如此每管反應(yīng)體系中便合成以各自的雙脫氧堿基為 3端的一系列長度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后，分 4個泳道進行凝膠電泳， 分離長短不一的核酸片段 ，長度相鄰的片段相差一個堿基。經(jīng)過放射自顯影后，根據(jù)片段 3端的雙脫氧核苷，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法Seq雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法測序峰圖雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法意義 快速和準確地獲取生物體的遺傳信息對于生命科快速和準確地獲取生物體的遺傳信息對于生命科學(xué)研究一直具有十分重要的意義。對于每個生物體來學(xué)研究一直具有十分重要的意義。對于每個生物體來說，基因組包含了整個生物體的遺傳信息。測序技術(shù)說，基因組包含了整個生物體的遺傳信息。測序技術(shù)能夠真實地反映基因組能夠真實地反映基因組DNADNA上的遺傳信息，進而比較上的遺傳信息