常規(guī)抗血清制備方法

1、常規(guī)抗血清制備方法 第一節(jié)第一節(jié) 常規(guī)抗血清的制備方法常規(guī)抗血清的制備方法一、動(dòng)物的免疫二、抗血清的采集1、免疫動(dòng)物的選擇2、抗原接種3、佐劑的應(yīng)用動(dòng)物的免疫動(dòng)物的免疫免疫動(dòng)物的選擇免疫動(dòng)物的選擇種屬與品系經(jīng)濟(jì)性“R”型與“H”型經(jīng)驗(yàn)性適配抗原接種抗原接種劑量：注射途徑：間隔與免疫時(shí)間：接種次數(shù)：佐劑的概念與種類佐劑的概念與種類概念：與抗原同時(shí)或先于抗原進(jìn)入 機(jī)體，以提高抗原的免疫原 性的物質(zhì)。種類：非免疫原性物質(zhì) 免疫原性物質(zhì)佐劑的作用機(jī)理佐劑的作用機(jī)理延長抗原的作用時(shí)間增強(qiáng)吞噬作用刺激抗原提呈促進(jìn)細(xì)胞因子分泌誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分裂、增殖影響T細(xì)胞“極化”1、采集方法2、血清的分離與滅活抗血清的采

2、集抗血清的采集采集方法采集方法一次性采集多次性采集抗血清的分離與滅活抗血清的分離與滅活血清析出的溫度血清的滅活 第二節(jié)第二節(jié) 單克隆抗體的制備方法單克隆抗體的制備方法一、單克隆抗體與雜交瘤技術(shù)二、單克隆抗體的制備過程三、單克隆抗體的特性單克隆抗體與雜交瘤技術(shù)單克隆抗體與雜交瘤技術(shù)1、單克隆抗體2、雜交瘤技術(shù)表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體 由一個(gè)識(shí)別單一抗原決定由一個(gè)識(shí)別單一抗原決定簇（表位）的簇（表位）的B細(xì)胞克隆所產(chǎn)細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的同源抗體。生的同源抗體。雜交瘤技術(shù)雜交瘤技術(shù) 通過融合經(jīng)免疫的小鼠脾細(xì)胞和建系小鼠骨髓瘤細(xì)胞，以獲得同時(shí)具有抗體

3、分泌功能和保持細(xì)胞永生性特征的雜交瘤細(xì)胞克隆。是獲取單克隆抗體的主要技術(shù)途徑。單克隆抗體制備過程單克隆抗體制備過程1、致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備2、骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備3、細(xì)胞融合4、選擇性培養(yǎng)5、抗體分泌細(xì)胞的篩選6、克隆化過程7、單克隆抗體的制取抗原致敏淋巴細(xì)胞骨髓瘤 細(xì)胞融合選擇性 培養(yǎng)抗體分泌細(xì)胞篩選克隆化單抗制取單抗純化單抗鑒定致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備動(dòng)物選擇：品系、年齡、性別、健康狀態(tài)抗原接種：方式體內(nèi)、體外 劑量g 次數(shù)視抗原而定 間隔視抗原而定 佐劑視抗原而定收集時(shí)間：末次接種后72h骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備細(xì)胞株處于良好的生長狀態(tài)細(xì)胞株保持HGPRT缺陷狀態(tài)細(xì)胞融合細(xì)

4、胞融合方式：物理、化學(xué)、生物PEG融合要點(diǎn)：（見圖）致敏淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞離心 1000rpm 10min50%PEG 1ml培養(yǎng)液 10ml離心 1000rpm 7min37。C搖動(dòng)、由慢漸快1min、靜止加入HAT培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，置于培養(yǎng)孔內(nèi)選擇性培養(yǎng)選擇性培養(yǎng)隨機(jī)融合后的細(xì)胞類型HAT選擇培養(yǎng)原理隨機(jī)融合后的細(xì)胞類型隨機(jī)融合后的細(xì)胞類型細(xì)胞組合 HGPRT 生長狀態(tài)淋巴細(xì)胞 + 骨髓瘤 + 長期生長淋巴細(xì)胞 + 淋巴細(xì)胞 + 短期生長骨髓瘤 + 骨髓瘤 不能生長未融合淋巴細(xì)胞 + 短期生長未融合骨髓瘤 不能生長HAT選擇培養(yǎng)原理選擇培養(yǎng)原理核苷酸從頭合成途徑（de novo synthe

5、sis）核苷酸補(bǔ)救合成途徑（salvage synthesis）HAT核苷酸DNA氨基碟呤（A）次黃嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）抗體分泌細(xì)胞的篩選抗體分泌細(xì)胞的篩選對(duì)篩選方法的要求： 多大量樣品一次檢測(cè) 快迅速取得檢測(cè)結(jié)果 準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果可靠性高 靈檢測(cè)方法靈敏度高常用篩選方法： ELISA、RIA、CDC、IFA等克隆化過程克隆化過程概念：建立單一細(xì)胞克隆方法：有限稀釋法克隆建立的標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)兩次以上100%陽性孔飼養(yǎng)細(xì)胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾細(xì)胞有限稀釋法有限稀釋法計(jì)數(shù)103/ml102/ml10/ml孔單克隆抗體的制取單克隆抗體的制取制取方式：體外培養(yǎng)罐法體內(nèi)腹腔接種純化：鹽析、層析、制備

6、型HPLC鑒定：特征鑒定Ig類型、親和力、效價(jià)、特異性決定簇鑒定是否針對(duì)同一決定簇多抗與單抗制劑的比較多抗與單抗制劑的比較 多抗 單抗 單抗 （血清） （腹水） （培養(yǎng)上清）特異性抗體含量（mg/ml） 無關(guān)Ig含量（mg/ml） 10 0.5-1 其他血清蛋白 大量 極少 均一性 + +特異性 多決定簇 單決定簇 單決定簇穩(wěn)定性 較好 略差 略差重復(fù)性 差 好 好單克隆抗體的特性單克隆抗體的特性1、理化性狀高度均一2、抗原結(jié)合性高度特異3、生物活性高度單一 第三節(jié)第三節(jié) 抗體的純化與鑒定抗體的純化與鑒定一、抗體純化的目的與方法二、純化抗體的鑒定與保存抗體純化的目的抗體純化的目的1、去除雜蛋白2、去除雜抗體3、去除非同類抗體抗體純化的方法抗體純化的方法1、鹽析、層析技術(shù)2、抗原吸附純化抗體的鑒定純化抗體的鑒定1、多克隆抗體的鑒定2、單克