課程論文-葡萄逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆

1、青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 本 科 生 課 程 論 文題 目: 葡萄逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆 姓 名: 劉麗雪 學(xué) 院: 生命科學(xué)學(xué)院 專 業(yè)： 生物技術(shù) 班 級(jí)： 2007級(jí)4班 學(xué) 號(hào)： 20072833 指導(dǎo)教師： 薛仁鎬 完成時(shí)間： 2010.8.15 2010年8月20日葡萄逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆生物技術(shù) 劉麗雪指導(dǎo)教師 薛仁鎬摘要：本文以葡萄幼苗為材料，依據(jù)基因組序列，設(shè)計(jì)引物，以基因組DNA為模板，利用PCR技術(shù)，對(duì)葡萄逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子進(jìn)行了擴(kuò)增，獲得了約1.4 kb的啟動(dòng)子序列，將啟動(dòng)子片段回收后連接到T載體，經(jīng)酶切鑒定結(jié)果表明，所需啟動(dòng)子成功構(gòu)建到T-A載體。葡萄逆境脅

2、迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆對(duì)下一步抗逆調(diào)控分子機(jī)制研究及作物分子育種具有重要理論和實(shí)際意義。關(guān)鍵詞：逆境脅迫；啟動(dòng)子；PCR擴(kuò)增；克隆Cloning of Adversity Stress Promoter in GrapesStudent majoring in Biotechnology Liu lixue Tutor Name Xue Ren-GaoAbstract: The promoter of gene was amplified by PCR technology using genomic DNA of grapes as template in this study. The 1.

3、4 kb fragment of promoter was then ligated to the T cloning vector and confirmed by digestion with endonuclease and sequencing. Cloning of adversity stress promoter has important significance on molecular regulation mechanism of adversity and genetic breeding in crop.Key words: Stress tolerance；prom

4、oter；PCR amplification；Cloning 1. 引言葡萄（Vitis vinifera L.）在植物學(xué)分類中屬于葡萄科(Vitaceae Lindley 或 Ampelideae Kunih)葡萄屬(Vitis L.)的藤本漿果。葡萄科中有12個(gè)屬，約600個(gè)種1。葡萄是最古老的被子植物之一，起源于歐、亞大陸和北美洲的連片地區(qū)。主要栽培類型則起源于中亞西亞一帶，主要分布于世界的溫帶、亞熱帶、熱帶地區(qū)，主要野生于森林、山坡或河谷等地。葡萄科中只有葡萄屬有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，并且得到廣泛的栽培和較深入的研究。葡萄是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的漿果，素有水果皇后的美譽(yù)，廣泛應(yīng)用于我們的日常生活

5、中，它不但營(yíng)養(yǎng)豐富、用途廣泛：色美、氣香，味可口，是果中佳品，既可鮮食又可加工成各種產(chǎn)品，如葡萄酒、葡萄汁、葡萄干等，而且果實(shí)、根、葉皆可入藥，全身都是寶。是國(guó)際市場(chǎng)上重要的商品。啟動(dòng)子決定著基因時(shí)空表達(dá)的特異性，目前通常采用分子生物學(xué)手段對(duì)生物反應(yīng)器進(jìn)行遺傳改良，希望插入的外源目的基因能夠限定在某一特定的組織或部位進(jìn)行高效表達(dá)，在不影響該生物反應(yīng)器其它特性的前提下，能夠集中在靶組織方便地收集表達(dá)產(chǎn)物。植物啟動(dòng)子由核心元件和上游元件構(gòu)成,如TATA-box和起始因子(initiator)。在逆境相關(guān)基因的啟動(dòng)子序列中還存在一些與逆境誘導(dǎo)相關(guān)，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的順式作用元件。目前研究較深入的有：

6、脫落酸響應(yīng)元件 5-8、乙烯響應(yīng)元件 6-8、茉莉酸類物質(zhì)應(yīng)答元件8、低溫響應(yīng)元件12和干旱應(yīng)答元件3-6等。ABA誘導(dǎo)裘達(dá)基因啟動(dòng)子存在一個(gè)PyACGTGGC保守序列，該序列在小麥胚胎發(fā)生晚期表達(dá)基因E3中首次被確定為ABA應(yīng)答元俘，核心序列為A/GCGT。擬南芥RD29B基因啟動(dòng)子中存在兩個(gè)ABRE，只有遮兩個(gè)元件相置作用，形成ABA應(yīng)答復(fù)合體，才能指導(dǎo)核心啟動(dòng)子的ABA誘導(dǎo)活性2。由于信號(hào)測(cè)激雨具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子稱為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。該類啟動(dòng)子可以快速有效地誘。在逆境相關(guān)基因的啟動(dòng)子序列中還存在一些與逆境誘導(dǎo)相關(guān)，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的順式作用元件。目前研究較深入的有：脫落酸響應(yīng)元件與基因上游

7、啟動(dòng)子中關(guān)鍵順式元件特異結(jié)合，增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性，提高目的基因的表達(dá)量。旱、高鹽、低溫和高溫等，可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的主要機(jī)制之一是逆境脅迫有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子非生物脅迫，如導(dǎo)轉(zhuǎn)錄基因的“開(kāi)、關(guān)”：可根據(jù)需要在植物特定發(fā)育階段、組織器宮或生長(zhǎng)環(huán)境下接受誘導(dǎo)蕾號(hào)，誘導(dǎo)基因表達(dá)；也可以隨時(shí)解除脅迫，停止表達(dá)。非生物脅迫，如干旱、高鹽、低溫和高溫等，可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的主要機(jī)制之一是逆境脅迫有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(調(diào)節(jié)蛋白)與基因上游啟動(dòng)子中關(guān)鍵順式元件特異結(jié)合，增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性，提高目的基因的表達(dá)量。rd29A啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)目的基因在干旱、低溫和ABA等非生物脅迫下表達(dá)，

8、是目前抗逆植物熬因工程中慮用最廣泛的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。Kasuga等7分別利用35S啟動(dòng)子和脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A驅(qū)動(dòng)擬南芥DREBIA轉(zhuǎn)化擬南芥，rd29A：DREBlA轉(zhuǎn)基因植株的脅迫耐性明顯高于35S：DREBIA的轉(zhuǎn)基因植株；而且在脅迫誘導(dǎo)下，rd29A驅(qū)動(dòng)的目標(biāo)基因表達(dá)積累與脅迫誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)在相同水平中，說(shuō)明誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能更有效地提高植物對(duì)低溫、干旱和高鹽的耐受性。冬麥bltl01基因啟動(dòng)子受低溫誘導(dǎo)，在其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-168到-275區(qū)段內(nèi)存在一個(gè)高度保守的TCAlike元件(TCATCTTCTr)，Brown等首次發(fā)現(xiàn)該元件與誘導(dǎo)目的基因在低溫脅迫下高效表達(dá)密切相關(guān)。2

9、. 材料與方法2.1 材料菌種和載體：大腸桿菌DH5由本實(shí)驗(yàn)室提供，T載體購(gòu)于TaKaRa公司。酶及化學(xué)試劑：各種限制性內(nèi)切酶開(kāi),關(guān)、Hind、EcoR均購(gòu)于TaKaRa公司。其他所需藥品均為分析純。開(kāi),關(guān)開(kāi),關(guān)2.2.1 引物序列的設(shè)計(jì) 利用已知的基因序列找到其逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的序列并由此設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)的引物如下：VVESTPF1 ACACTCGTCCCATCTCCCATCVVESTPR1 TCCAAGTCTTTCCTAGTTGCTC2.2.2 組培培養(yǎng)葡萄幼苗 1/2MS生根培養(yǎng)基根據(jù)培養(yǎng)基配方，各種母液的濃度及要求配制的總量計(jì)算好需要各種母液的量，分別量取50 mL大量元素、10 m

10、L微量元素、10 mL鐵鹽、10 mL有機(jī)物、10 mL CaCl2等母液。加入30g/L蔗糖，加入IAA，1 mg/mL，用磁力攪拌器攪拌溶解后，定容。用1M NaOH或0.1M HCL調(diào)節(jié)pH值到5.8。加入瓊脂，8g/L。分裝，一般1L分為2426個(gè)培養(yǎng)瓶；封口。高壓蒸汽滅菌。121下滅菌20 min。在超凈工作臺(tái)上把葡萄幼苗剪切帶芽幼莖接到1/2MS生根培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，完成后放入恒溫箱中保存，定期觀察花生的生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)至幼莖生根發(fā)芽并發(fā)育成小苗，即可進(jìn)行試驗(yàn)。2.2.3 基因組DNA的PCR擴(kuò)增以提取的葡萄基因組DNA為模板，利用設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得基因片段?；旌弦撼?/p>

11、分 加入體積(50l)10×buffer(Mg2+) 5 LdNTP(2.5mM) 8 L引物1 (20M) 1 L引物2 (20M) 1 LTaq(5U/l) 0.5 LDNA/cDNA 12 LddH2O 22.5 L將混合好的液體均勻的分裝到兩個(gè)管中，每管25L.(2) 反應(yīng)程序：各組分充分混勻后，在PCR儀上擴(kuò)增。反應(yīng)程序如下：94預(yù)變性5min94變性40s45-55退火40s 72延伸2min 完成30個(gè)循環(huán)72延伸10min在PCR儀上擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加10L6×Loading buffe，混勻，取6L在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定，觀察結(jié)果。2.2

12、.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 制備凝膠：在錐形瓶中加入0.4g的瓊脂糖和40mL的TAE緩沖液，充分溶解后，冷卻后加入染料4L。電泳板安放好梳子后倒膠，注意倒膠時(shí)要慢慢倒，不能有氣泡產(chǎn)生。室溫下放置，直至凝膠完全凝固。 在有DNA的離心管里加入6×Loading buffer，混勻。將電泳板放入盛有緩沖液的電泳槽內(nèi)。注意點(diǎn)樣孔端在電源的負(fù)極。然后用移液槍進(jìn)行點(diǎn)樣，每孔點(diǎn)樣8L。 于電壓100V下電泳30-40 min。電泳結(jié)束后紫外燈上觀察條帶。2.2.5 基因片段的回收PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的基因片段用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。步驟為：層析柱的平衡：200L buff

13、er GPS，2支，室溫放置3-5min，12000rpm，離心2min，加700L水，12000rpm離心2min。放置待用。 切下目的基因片段，放入離心管中，稱量，按1g/mL加入Binding Buffer。55-60加熱7min，中間混勻2-3次。將回收的溶液加入平衡的離心柱中，10000rpm離心1min。棄下層溶液，加入300L Binding Buffer，1000rpm離心1min。棄下層溶液，加入700L SPW washing buffer，10000rpm離心1min。重復(fù)一次。棄下層溶液， 13000rpm離心1min，離心柱。在管中加入40L Elution buff

14、er，室溫放置10min，13000rpm離心1min。2.2.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體連接及連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化一般DNA片段的克隆實(shí)驗(yàn) 配制DNA溶液，pmD19-T Vector 1L加Insert DNA4L。 加入等量的（5L）Solution。 4過(guò)夜連接 全量的（10L）加入至100LJM109感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30min。 42加熱90S后，再在冰中放置1min。 加入750L LB培養(yǎng)基，37振蕩培養(yǎng)60分鐘。 在超凈工作臺(tái)上抽取10L，在抗Amp培養(yǎng)基上涂板，之后37培養(yǎng)12個(gè)小時(shí)，放置待用。2.2.8 連接目的基因質(zhì)粒的提?。?從制備的培養(yǎng)皿上挑連接目的基因的單菌落至15m

15、L LB培養(yǎng)基中，加入15L Amp ，37搖床培過(guò)夜。取搖床過(guò)夜的培養(yǎng)基至離心管中，10000rpm離心1min，根據(jù)菌量的多少提取適量的菌。 棄上清，加入250L Solution/RNaseA，混勻。 加入250L Solution，顛倒混勻，靜置2min。 加入350L Solution，加入后快速混勻，靜置5min，會(huì)出現(xiàn)白色沉淀。 12000rpm離心10min。用移液槍吸出上層溶液至層析管中，8000rpm離心2min。 加入700L DNA Wash Buffer洗滌，10000rpm離心1min，重復(fù)一次。 10000rpm離心2min，去除殘液，37烘干5min。 轉(zhuǎn)入新的

16、離心管中，加50L的Eolution Buffer，37靜置5min，之后10000rpm離心。 電泳鑒定。3 結(jié)果與分析：3.1 PCR擴(kuò)增圖3-1 PCR產(chǎn)物的凝膠電泳分析啟動(dòng)子序列的預(yù)期大小為1354bp。以提取的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的啟動(dòng)子片段后，進(jìn)行了瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增得到了約1400 bp大小的一條DNA片段，與預(yù)期的啟動(dòng)子大小一致（圖3-1）。其中1列與2列為溫度梯度比較，1列是在退火溫度為58時(shí)的PCR結(jié)果，2列是退火溫度為56時(shí)的結(jié)果，下邊的淺色條帶非特異性DNA 片段。3.2 質(zhì)粒提取鑒定圖3-2 左側(cè)為Marker，右側(cè)為提取連接目的基因

17、后的質(zhì)粒電泳將PCR產(chǎn)物回收后，連接到T載體上。電泳結(jié)果表明目的DNA片段已與質(zhì)粒連接。3.3 酶切鑒定和序列鑒定圖3-3左側(cè)為Marker，右側(cè)為雙酶切后電泳，最后為質(zhì)粒將PCR產(chǎn)物回收后，連接到T-A載體，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞，大量繁殖后，提取質(zhì)粒DNA，用EcoRI和Hind雙酶切進(jìn)行了鑒定（圖3-3）。結(jié)果出現(xiàn)了1700 bp和2500 bp左右兩個(gè)DNA片段，表明目的DNA片段已與質(zhì)粒連接。4 討論通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析，可以看出，葡萄逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆已經(jīng)完成，且轉(zhuǎn)染順利，下一步的目標(biāo)是將其進(jìn)行轉(zhuǎn)接至質(zhì)粒中，進(jìn)行染色觀察其是否表達(dá)，并進(jìn)行組織表達(dá)分析，以確定其在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)

18、逆境起到的具體作用。以研究葡萄逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控及在育種中的應(yīng)用。但是最后的正反序鑒定結(jié)果中并沒(méi)有檢測(cè)出正反載體的結(jié)果，可能原因是： 提取的質(zhì)粒不純有雜質(zhì)，進(jìn)行正反鑒定切不出結(jié)果。所用的Stu 酶失活沒(méi)有將目的基因切開(kāi)。目的基因沒(méi)有完全連接到載體上，沒(méi)有出現(xiàn)Stu 酶的酶切位點(diǎn)。應(yīng)該用其他酶進(jìn)行酶切比較試驗(yàn)。5 前景與展望植物逆境脅迫抗性的功能基因組研究經(jīng)過(guò)多年的努力，方法和技術(shù)體系已日益成熟，并取得了很大的進(jìn)展，已獲得了很多與植物脅迫抗性相關(guān)的基因位點(diǎn)和脅迫相關(guān)基因，調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子，隨著植物逆境脅迫抗性的功能基因組研究的深入，人們將會(huì)對(duì)植物逆境脅迫抗性的生理生化的分

19、子機(jī)理有一個(gè)全面的認(rèn)識(shí)，進(jìn)而把握與其相關(guān)的基因數(shù)目及其在代謝和調(diào)控中的作用，合理地選擇和優(yōu)化植物逆境脅迫抗性中的關(guān)鍵代謝和調(diào)控過(guò)程的基因，用于植物逆境脅迫抗性的標(biāo)記輔助選育和基因工程改良，促進(jìn)逆境脅迫抗性的作物材料和品種的育成和生產(chǎn)應(yīng)用。致謝感謝青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院四年來(lái)的培養(yǎng)，在此，我真誠(chéng)地向我尊敬的老師們和母校表達(dá)我深深的謝意！這篇論文是在我的導(dǎo)師薛仁鎬老師的多次指導(dǎo)下完成的。從論文的選題到結(jié)構(gòu)安排，從內(nèi)容到文字潤(rùn)飾，都凝聚了他大量的心血。在這篇論文的寫(xiě)作過(guò)程中，薛仁鎬老師不辭辛勞，多次與我就論文中許多核心問(wèn)題作深入細(xì)致地探討，給我提出切實(shí)可行的指導(dǎo)性建議，并細(xì)心全面地修改了我的論文。

20、薛仁鎬老師對(duì)本論文從選題、構(gòu)思、資料收集到最后定稿的各個(gè)環(huán)節(jié)給予細(xì)心的指引和教導(dǎo) ，并最終得以完成畢業(yè)論文，對(duì)此，我打心眼里表示我最衷心的感謝.薛老師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、豐富淵博的知識(shí)、敏銳的學(xué)術(shù)思維、精益求精的工作態(tài)度、積極進(jìn)取的科研精神以及誨人不倦的師者風(fēng)范是我畢生的學(xué)習(xí)楷模。薛老師的高深精湛的造詣與嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的治學(xué)精神將永遠(yuǎn)激勵(lì)著我。薛老師這種一絲不茍的負(fù)責(zé)精神，使我深受感動(dòng)。在此，請(qǐng)?jiān)试S我向尊敬的薛仁鎬老師表示真摯的謝意！其次，我要感謝魏璇師姐。在百忙之中抽出時(shí)間指導(dǎo)我做實(shí)驗(yàn)，幫助我搜集文獻(xiàn)資料，幫助我理清論文寫(xiě)作思路，對(duì)我的論文提出了諸多寶貴的意見(jiàn)和建議。對(duì)師姐的幫助表示真摯的感謝。 在論

21、文的寫(xiě)作過(guò)程中，也得到了許多同學(xué)的寶貴建議，同時(shí)還得到實(shí)驗(yàn)室其他師姐的支持和幫助，在此一并致以誠(chéng)摯的謝意。 最后，衷心感謝所有老師對(duì)我的栽培、支持和鼓勵(lì)，感謝所有朋友的關(guān)心和幫助。向在百忙中抽出時(shí)間對(duì)此論文進(jìn)行評(píng)審并提出寶貴意見(jiàn)的各位專家表示衷心地感謝！參考文獻(xiàn)：1 孔慶山主編.中國(guó)葡萄志.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社.2004. 2 李楊漢主編.植物學(xué)Z .上海科學(xué)技術(shù)出版社出版.1984.3 賀普超主編.葡萄學(xué)Z.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社出版.1999.4 Backhaus R ARubber formation in plants1 mini-reviewIsrael J Bor,198534：283-

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