殼寡糖衍生物

1、1 緒論1.1 殼寡糖及其衍生物甲殼素和殼聚糖(CTS)具有許多天然的優(yōu)良性質(zhì)，如吸濕透氣性、反應(yīng)活性、生物相容性、生物可降解性、無抗原性、無致炎性、無有害降解產(chǎn)物、吸附性、粘合性、抗菌性和安全性等。從而被廣泛應(yīng)用于紡織工業(yè)、生物醫(yī)學(xué)和日用環(huán)保等方面。CTS還被譽(yù)為人體的“第6生命要素”。有人評論認(rèn)為甲殼素將成為21世紀(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一。曾有科學(xué)家預(yù)言“21世紀(jì)將是甲殼素的世紀(jì)”。近幾十年來甲殼素和CTS已成為日、美等國家的熱門研究課題。我國從20世紀(jì)中期也開始開展有關(guān)的研究和產(chǎn)品開發(fā)。CTS的結(jié)構(gòu)式如下圖。由于甲殼素和CTS的水不溶性限制了它們的應(yīng)用范圍，而通過降解甲殼素或殼聚糖得到的殼寡糖(

2、其聚合度在2O以)是一類無毒且具有良好的生物降解性和生物相容性的高分子物質(zhì)，其優(yōu)越的生物活性功能、良好的成膜特性和較強(qiáng)的抗菌防腐保鮮能力已引起國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注和重視。經(jīng)過生物降解的低分子量殼寡糖具有廣譜的殺菌作用。殼寡糖是氨基葡萄糖通過-1，4-糖苷鍵連接而成的相對分子質(zhì)量低于10 000的低聚糖。低黏度和良好的水溶性使殼寡糖比殼聚糖展現(xiàn)出更獨(dú)特的生理活性和功能性質(zhì)，如抗菌、抗腫瘤、提高植物防御能力等。因此，這些寡糖的研究引起了國內(nèi)外重視，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、食品、化妝品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。植物誘導(dǎo)抗性領(lǐng)域殼寡糖作為一種激發(fā)子，可有效地誘導(dǎo)植物抗病性，增強(qiáng)植物對病蟲害的防御能力。其作為

3、植物免疫激活因子的基礎(chǔ)研究始于20世紀(jì)60年代。Ayers等1于1976年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁的寡糖碎片能誘導(dǎo)植物植保素(phytoalexin)合成仁；1985年Albersheim2首次提出了寡糖素(oligosaccharins)這個(gè)新概念和新領(lǐng)域，每種活性寡聚糖可發(fā)出調(diào)節(jié)特定功能的信息，激活防御反應(yīng)和調(diào)控植物生長，產(chǎn)生具有抗病害的活性物質(zhì)，抑制病害的形成。活性寡聚糖是一類具有一定結(jié)構(gòu)和生物活性的聚合體，國際上研究較多的是植物及微生物細(xì)胞壁多糖降解的寡糖片斷。越來越多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物細(xì)胞壁不僅能起到防御的結(jié)構(gòu)屏障作用，而且當(dāng)植物受到病菌感染時(shí)能產(chǎn)生積極的防御反應(yīng)。（1）對煙草的誘導(dǎo)抗性煙草花葉

4、病毒病(TMV)在生產(chǎn)上的危害很大，至今仍缺乏有效的治療藥劑。目前，選擇合適的誘抗劑不失為一種有效的防治方法，其廣闊的應(yīng)用前景已引起人們的高度重視。郭紅蓮等3以殼寡糖誘導(dǎo)煙草枯斑三生葉(Nicotiana tabacum var.samsun NN)寄主后，調(diào)查了其對病斑的抑制率，同時(shí)研究了殼寡糖單獨(dú)處理和以病毒粒子侵染誘導(dǎo)的病程相關(guān)蛋白的差異，結(jié)果表明，殼寡糖處理對TMV侵染有保護(hù)作用，施用后7d，以濃度為50g/mL和75g/mL時(shí)其對枯斑的抑制效果為好。通過體外測試發(fā)現(xiàn)，殼寡糖對TMV粒子有鈍化作用。單獨(dú)施用殼寡糖可以誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生6條耐堿性的PR蛋白，其中1條區(qū)別于TMV侵染誘導(dǎo)的PR。

5、Lu等4將殼寡糖噴灑于感染煙草花葉病毒（TMV）的煙草葉片上，在接種后24小時(shí)發(fā)現(xiàn)50微克/毫升殼寡糖對煙草花葉病毒的抑制率最高，研究結(jié)果表明，殼寡糖誘導(dǎo)煙草防御是與N-介導(dǎo)的抗性有關(guān)。（2）對水稻的誘導(dǎo)抗性稻瘟病和紋枯病是水稻的重要病害，在世界范圍內(nèi)每年造成上億千克產(chǎn)量損失，高發(fā)病時(shí)甚至可以造成減產(chǎn)50%。Obara等5用固相微萃取技術(shù)和GC-MS法分析不同誘導(dǎo)劑釋放的揮發(fā)物作為誘導(dǎo)劑處理稻瘟病菌Pyricularia oryzae，將病菌嫁接到水稻葉片上(含有殼寡糖)，發(fā)現(xiàn)不同的誘導(dǎo)劑產(chǎn)生的揮發(fā)物在定性和定量上有一些差別。Inui等6將一系列濃度的殼寡糖放到水稻培養(yǎng)液中，也發(fā)現(xiàn)其能夠誘導(dǎo)苯

6、丙氨酸解氨酶(PAL)。胡健等7結(jié)果表明：相對分子質(zhì)量不同的殼寡糖對供試水稻品種葉片幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)作用不同，相對分子質(zhì)量為1 500的殼寡糖誘導(dǎo)效果最佳，而相對分子質(zhì)量為500的殼寡糖誘導(dǎo)效果最差。不同水稻品種對紋枯病的抗性不同，其幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)能力也不同，無論是苗期還是抽穗期，抗病能力強(qiáng)的水稻品種，幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)水平也高。寧偉等8對30株水稻幼苗發(fā)病情況的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，經(jīng)5g·mL-1殼寡糖處理的水稻植株抗稻瘟病能力明顯增強(qiáng)，病斑級數(shù)為23級，植株抗病級數(shù)為12級；而未經(jīng)殼寡糖處理的植株極大部分病斑為感病病斑，發(fā)病級數(shù)在45級。（3）對胡蘿卜的誘導(dǎo)抗性 Chris等9利用鏈霉菌N-

7、174殼聚糖酶制備了平均聚合度為7的(質(zhì)量濃度為0.2 %)的殼寡糖，并用其處理收獲后的胡蘿卜，針對其核盤霉菌，測量了它的抑制系數(shù)。發(fā)現(xiàn)核盤霉菌在馬鈴薯瓊脂上呈放射狀生長，這使得胡蘿卜在放置3 d以上時(shí)就開始腐爛。但當(dāng)在零度或使用殼寡糖處理后，就能夠誘導(dǎo)胡蘿卜對核盤霉菌產(chǎn)生抗體。（4）對番茄的誘導(dǎo)抗性 Noah等10研究了5 %或30 %乙酰化程度的幾丁質(zhì)、殼寡糖和殼聚糖對番茄Lycopersicon esculentum葉片中水解酶的誘導(dǎo)情況，發(fā)現(xiàn)乙?；潭鹊偷臍す烟菦]有誘導(dǎo)作用，而95 %乙酰化的殼寡糖是一個(gè)有效的抗病誘導(dǎo)劑。何培青等11研究了0.3 %殼寡糖誘導(dǎo)番茄葉片120 h后，其揮

8、發(fā)性物質(zhì)對番茄枯萎病菌Fusarium oxysporum孢子萌發(fā)和菌絲生長的影響，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，檢測誘導(dǎo)后番茄葉中揮發(fā)性物質(zhì)及植保素日齊素質(zhì)和量的變化。結(jié)果表明，經(jīng)殼寡糖誘導(dǎo)后，番茄葉中揮發(fā)性物質(zhì)對病菌的抑制率較對照組高。番茄葉中揮發(fā)性抗真菌物質(zhì)的總含量為對照組的1.49倍；氧合脂類、萜類及芳香類化合物的含量分別提高了61 %、10 %和69 %，其中(E)-2-乙烯醛的含量增加了64 %，水楊酸甲酯的含量增加了38 %。（5）對棉花的誘導(dǎo)抗性郭紅蓮等12研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖可以誘導(dǎo)棉花細(xì)胞活性氧代謝發(fā)生改變。他們以不同濃度殼寡糖為激發(fā)子，均可誘導(dǎo)棉花懸浮細(xì)胞的活性氧迸發(fā)，其峰值出

9、現(xiàn)時(shí)間都在2030 m in左右；此外，殼寡糖還可以誘導(dǎo)棉花細(xì)胞中活性氧清除酶系活性的變化，SOD和CA T活性變化的最大值在處理后6090 min左右。濃度不同的殼寡糖在誘導(dǎo)趨勢變化上卻相似。他們13以殼寡糖誘導(dǎo)處理細(xì)胞，加入終濃度分別為0.05 mmol/L的LaCl3和三氟乙酸(TFA)，處理過程中細(xì)胞保持在懸浮狀態(tài)。研究表明，殼寡糖可誘導(dǎo)棉花細(xì)胞苯丙氨酸解氨酶(PAL)和超氧化物歧化酶(SOD)活性增加，鈣信使系統(tǒng)參與殼寡糖對棉花細(xì)胞的誘抗作用。（6）對小麥的誘導(dǎo)抗性日本京都大學(xué)Ishihara Atsushi14用殼寡糖測試燕麥時(shí)，發(fā)現(xiàn)其能夠誘導(dǎo)燕麥HTT酶的活性，從而誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗病

10、能力。劉曉等15用殼寡糖和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)以不同方式處理小麥種子，測定其從G1期啟動(dòng)進(jìn)入S期和G2-M期的胚細(xì)胞百分率和小麥黃化苗的生長，結(jié)果表明，殼寡糖可促進(jìn)小麥種子胚細(xì)胞周期啟動(dòng)并促進(jìn)小麥根數(shù)目增加，說明殼寡糖對小麥種子的胚細(xì)胞分裂有促進(jìn)作用。殼寡糖預(yù)處理小麥種子可解除DON對小麥黃化苗生長及胚細(xì)胞啟動(dòng)的抑制作用，表明寡聚糖可提高植物對病原菌毒素的抗耐性，這可能是寡聚糖誘導(dǎo)植物提高抗病性的重要機(jī)制之一。Takezawa16用小麥培養(yǎng)的細(xì)胞來研究Ca2+的傳遞作用和誘導(dǎo)細(xì)胞對真菌病原體的抵抗作用。以typhula ishikariensis衍生的物質(zhì)來誘導(dǎo)用小麥培養(yǎng)的細(xì)胞，結(jié)果顯

11、示，ccd-1基因密碼是一個(gè)14 kDa的Ca2+-蛋白質(zhì)復(fù)合物，它具有一個(gè)偏酸性的兩性分子特征。殼寡糖誘導(dǎo)顯示了它能夠轉(zhuǎn)換Ca2+信號，這能使植物啟動(dòng)自己的防御體系，免受真菌的入侵。（7）對草莓的誘導(dǎo)抗性郭紅蓮等17以草莓懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞為對象，研究了殼寡糖處理對活性氧代謝的效應(yīng)。結(jié)果表明，殼寡糖可誘導(dǎo)草莓懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的活性氧迸發(fā)，其峰值出現(xiàn)于2030 min，同時(shí)也可誘導(dǎo)活性氧清除酶活性上升，SOD和CAT活性的最大值出現(xiàn)在處理后6090 m in。此外，他們還研究了殼寡糖與草莓的結(jié)合過程18。（8）對油菜的誘導(dǎo)抗性陸引罡等19以殼聚糖酶降解殼聚糖而得的殼寡糖為基本成分，配以化肥、微量元素及

12、防腐劑等成分，混合調(diào)制成較穩(wěn)定的膠體溶液后拌種，發(fā)現(xiàn)其對油菜種子發(fā)芽和出苗均無顯著影響，但可促進(jìn)油菜生長，提高壯苗率，增加產(chǎn)量，增產(chǎn)幅度在4.3 %9.7 %，其增產(chǎn)以增加每角果粒數(shù)為主。殼寡糖拌種可明顯抑制油菜菌核病的發(fā)生，對3個(gè)油菜品種的防治率分別為34.19 %44.10 %。室內(nèi)測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用較高濃度的殼寡糖(0.50.75 mg·mL-1)拌種，其對油菜菌核病菌菌絲生長有抑制作用，表明殼寡糖對油菜菌核病菌有誘導(dǎo)抗性。在醫(yī)療領(lǐng)域中的應(yīng)用殼寡糖具有多方面生理功能以及抗腫瘤效果。早在1985年，Suzuki等就用甲殼六聚糖對小鼠進(jìn)行抗腫瘤測試，得到了明顯效果；1997年，王中和

13、等又用低分子殼多糖口服液對臨床患者進(jìn)行輔助治療，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的總數(shù)保持穩(wěn)定，T淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著上升，也說明了低分子殼多糖的抗腫瘤輔助療效。因此，它可作為早期腫瘤的治療藥物。其作用機(jī)理為20：N-乙酰-D糖胺(GlcNA )或D-糖胺(GLcN)殘基與巨噬細(xì)胞表面受體結(jié)合后，激活巨噬細(xì)胞釋放IL-1，同時(shí)引起T細(xì)胞表面IL-2受體表達(dá)，而這又加速了T細(xì)胞成熟而釋放IL-2，IL-2與受體結(jié)合后，進(jìn)一步加速T細(xì)胞分化成熟為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，從而產(chǎn)生抗腫瘤作用。溶菌酶作為消炎劑在醫(yī)藥上應(yīng)用廣泛，在食品中用作防腐劑在動(dòng)物的血和尿中也含有一定量的溶菌酶，所以溶菌酶可以作為檢驗(yàn)?zāi)撤N病患的一個(gè)指標(biāo)。

14、人體血液和尿中含溶菌酶，患者比正常人含該菌酶高。有人選取甲殼四聚糖并與對-硝基苯酚合成，產(chǎn)生發(fā)色基團(tuán)，可作為臨床診斷試劑，快速而簡便，可在醫(yī)學(xué)、畜牧中應(yīng)用。Nanjo等用甲殼五糖合成了衍生物P-硝基酚五(N-乙?；?-殼寡五糖，用作溶菌酶培養(yǎng)基，結(jié)果表明比四糖作為發(fā)色基團(tuán)效果更好。在食品和化妝品領(lǐng)域中的應(yīng)用幾丁寡糖具有柔和甜味，可作為素材加以利用。殼寡糖也具有增強(qiáng)人體免疫力的作用，有希望在改善食品結(jié)構(gòu)，提高食品保水性能方面有重要作用。另外，甲殼低聚糖在食品中還有一定的抗菌作用21，研究結(jié)果表明相對分子質(zhì)量為1 500的殼寡糖，質(zhì)量濃度1 g·L-1 pH 6.0時(shí)，其抑菌效果很好，但

15、pH>6.0時(shí)，其抑菌率開始減小并有所下降。而相對分子質(zhì)量為440 000的殼聚糖，質(zhì)量濃度為2.5 g·L-1時(shí)，在pH 5.2以下，抑菌作用基本上與1 g·L-1的甲殼低聚糖相當(dāng)。它的作用機(jī)理有報(bào)道說，低分子量殼聚糖能使DNA轉(zhuǎn)錄受阻，從而顯示出抗菌性影響細(xì)菌繁殖。甲殼低聚糖作為化妝品材料22，效果很好，首先甲殼質(zhì)的超微粉末可加速其滲透作用；其次，殼寡糖鹽的水溶液可改善皮膚和毛發(fā)的保濕功能且具有很強(qiáng)的抑菌性，邵健、楊宇民在低聚氨基葡萄糖的吸濕、保濕和抑菌性質(zhì)一文中對此作了很好的說明；再次，水溶性甲殼質(zhì)衍生物可開發(fā)出皮膚護(hù)理劑、毛發(fā)加工保護(hù)劑和防曬劑。1.2 殼寡糖

16、及其衍生物的應(yīng)用展望除了不能與堿性農(nóng)藥混合使用外，殼寡糖是一種良好的生物源農(nóng)藥，具有對環(huán)境無污染，能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等優(yōu)點(diǎn)。而植物誘導(dǎo)抗病性具有抗病譜廣、持續(xù)時(shí)間較長、可控的抗病性表達(dá)時(shí)間和空間等特點(diǎn)，這些特點(diǎn)決定了殼寡糖在植物誘導(dǎo)抗病性方面具有廣闊的應(yīng)用前景。高等植物的誘導(dǎo)抗病性從激發(fā)子與受體識別開始，到植物產(chǎn)生明顯的抗病防衛(wèi)反應(yīng)結(jié)束，在這一過程中，殼寡糖激發(fā)子誘導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)信號是多途徑的，研究其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程將增進(jìn)人們對植物防衛(wèi)反應(yīng)的認(rèn)識。但殼寡糖誘導(dǎo)的抗性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)節(jié)、在細(xì)胞表面的受體、誘導(dǎo)抗性基因的克隆、防御基因的調(diào)控方式等方面仍需深入研究。目前，中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所研制的

17、殼寡糖生物農(nóng)藥已獲得國家農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥臨時(shí)登記證，并與相關(guān)企業(yè)聯(lián)合，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)進(jìn)行大面積推廣，取得了明顯的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。相信隨著研究的進(jìn)一步深入，殼寡糖誘導(dǎo)的植物抗病性的作用機(jī)理將逐漸被了解，同時(shí)也可為植物抗病基因工程奠定理論基礎(chǔ)，殼寡糖及其衍生物的應(yīng)用前景將會(huì)更加廣闊。1.3 研究方向與思路經(jīng)過生物降解的低分子量殼寡糖具有廣譜的殺菌作用，但與其他化學(xué)合成的殺菌劑相比，其抗菌活性較低，因此擬在殼寡糖分子中引入一個(gè)抗菌活性骨架，來進(jìn)一步提高其抗菌活性。經(jīng)初步研究，苯并吡喃甲酸對多種植物病原菌具有良好的殺菌效果，因此本實(shí)驗(yàn)從殼寡糖出發(fā)與苯并吡喃類衍生物甲酸脫水縮合得到3種苯并吡喃基殼寡糖衍生物，利用

18、IR、UV等對化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 試劑與儀器表2.1 主要化學(xué)試劑一覽表試劑名稱分子式規(guī)格來源三氟乙酰乙酸乙酯CF3COCH2COOCH2CH3AR北京化學(xué)試劑公司5-NO2水楊醛C7H5NO2AR北京化學(xué)試劑公司5-氯水楊醛C7H5O2ClAR北京化學(xué)試劑公司3、5-二氯水楊醛C7H5o2Cl2AR北京化學(xué)試劑公司殼寡糖AR上海海曲化工有限公司乙腈CH3CN色譜純天津賽孚瑞科技有限公司TBTUAR吉爾生化（上海有限公司）DMSOCH3SOCH3AR天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司無水乙醇C2H6OAR天津市德恩化學(xué)試劑有限公司三乙胺N(CH2CH3)3AR天津市福晨化學(xué)試劑

19、廠石油醚AR天津市德恩化學(xué)試劑有限公司氫氧化鈉NaOHAR開封市芳晶化學(xué)試劑公司甲醇CH3OHAR天津市德恩化學(xué)試劑有限公司表2.2主要使用設(shè)備一覽表名稱生產(chǎn)廠家RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠SHB-3循環(huán)水多用真空泵鄭州杜甫儀器廠CL-2型恒溫磁力加熱攪拌器鄭州長城科工貿(mào)有限公司ZF-型三用紫外分析儀上海顧村電光儀器廠X-4數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)儀北京泰克儀器有限公司FT-IR 200型紅外光譜儀Thermo Nicolet公司BS110電子天平德國SARTORIU安捷倫1200型高效液相色譜儀安捷倫公司2.2 合成與分析苯并吡喃類甲酸酯a：R1=Cl,R2=H b: R1=NO2,R

20、2=H ; c: R1=Cl,R2=Cl在冰水浴的條件下向干凈的圓底燒瓶中依次加入12mmol三氟乙酰乙酸乙酯,10mmol水楊醛無水乙醇3mL哌啶8滴，放入攪拌磁子，進(jìn)行密閉攪拌。待有淡黃色物質(zhì)出現(xiàn)繼續(xù)反應(yīng)12小時(shí)，將無水乙醇利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀盡量除去。使其自然冷卻后加入適量石油醚放入冰箱內(nèi)結(jié)晶洗出，將產(chǎn)物用石油醚洗滌減壓抽濾得白色粗產(chǎn)物，用乙醇重結(jié)晶得較純產(chǎn)品，計(jì)算產(chǎn)率。苯并吡喃類甲酸的合成a：R1=Cl,R2=H b: R1=NO2,R2=H ; c: R1=Cl,R2=Cl在100mL的圓底燒瓶放入10mmol化合物2a，用甲醇溶解，約用甲醇18mL，再加入5mol/L的NaOH 3.0

21、mL,磁力攪拌，添加回流裝置，回流4h，自然冷卻后用6mol/L的HCl調(diào)pH值約等于2，出現(xiàn)白色固體，減壓抽濾，用蒸餾水洗滌，后用乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，烘干稱重，計(jì)算產(chǎn)率。2.2.3苯并吡喃基殼寡糖新衍生物在干凈的100mL的圓底燒瓶中依次加入1mmol殼寡糖，苯并吡喃甲酸8mmol，TBTU 12mmol，三乙胺22.4mmol,乙腈15mL，DMF 2.5mL，進(jìn)行常溫?cái)嚢?4h。將產(chǎn)物用無水乙醇進(jìn)行洗滌減壓抽濾，。將粗產(chǎn)品用甲醇進(jìn)行索式提取得較純產(chǎn)品。2.2.4紅外光譜分析取純凈的化合物約2 mg，干燥的KBr200 mg，置于瑪瑙研缽中，混合均勻，研成粉末。取適量混合物轉(zhuǎn)移至壓片磨具中，加

22、壓成透明或半透明薄片，置于紅外分光光度計(jì)中檢測，測試范圍4000400 cm-1。3 結(jié)果與分析3.1 苯并吡喃類衍生物酯和酸的結(jié)構(gòu)表征表3.1化合物（2a-2c）和（3a-3c）的物理常數(shù)化合物R1R2形態(tài)熔點(diǎn)/產(chǎn)率/%2aClH白色晶體702bNO2H白色晶體652cClCl白色晶體513aClH白色晶體853bNO2H白色晶體803cClCl白色晶體753.1.1液相分析苯并吡喃類衍生物酯和酸的液相光譜吸收見圖3.1、3.2、3.3。所用溶劑是甲醇和水，其速度分別是0.7mL/min,0.3mL/min。（）氯代苯并吡喃甲酸酯和酸的液相光譜圖圖3.1 氯代苯并吡喃甲酸酯的液相光譜圖3.2

23、氯代苯并吡喃甲酸的液相光譜有圖可知氯代苯并吡喃甲酸酯出峰時(shí)間是7.123min,而氯代苯并吡喃甲酸的出峰時(shí)間1.574min。（）硝基苯并吡喃甲酸酯和酸的液相光譜圖圖3.3硝基苯并吡喃甲酸酯的液相光譜圖3.4硝基苯并吡喃甲酸的液相光譜硝基苯并吡喃甲酸酯的出峰時(shí)間是4.958min，硝基苯并吡喃甲酸的出峰時(shí)間是一分鐘多。（3）3，5-二氯苯并吡喃甲酸酯和酸的液相光譜圖3.5 3，5-二氯苯并吡喃甲酸酯的液相光譜圖3.6 3，5-二氯苯并吡喃甲酸的液相光譜3，5-二氯苯并吡喃甲酸酯的出峰時(shí)間是12.595min，3，5-二氯苯并吡喃甲酸酯的出峰時(shí)間是一分鐘多。3.1.2紅外吸收分析（1）氯代苯并吡

24、喃甲酸酯和硝基、3，5-二氯苯并吡喃甲酸酯的紅外吸收圖譜分別見圖3.7、3.8、3.9.同時(shí)以氯代苯并吡喃甲酸酯的紅外吸收圖譜為例證實(shí)了酯的結(jié)構(gòu)。圖3.7氯代苯并吡喃甲酸酯的紅外吸收圖譜圖3.8硝基苯并吡喃甲酸酯的紅外吸收圖譜圖3.9 3,5-二氯苯并吡喃甲酸酯的紅外吸收圖譜化合物（2a2c）的紅外圖譜分析見表 3.2表3.2化合物（2a2c）的紅外圖譜化合物VOH / cm-1VAr-H/cm-1VCH3 / cm-1VC=O/ cm-1VAr/ cm-12a331430532987 139517001636 1564 14672b342630682985137517211619 1571

25、14782c331130802987 137217001633 1560 1459以（2a）為例進(jìn)行分析：3314cm-1是羥基的伸縮振動(dòng)吸收峰，3053 cm-1是苯環(huán)、雙鍵上的C-H伸縮振動(dòng)吸收峰, 2987 cm-1，1395 cm-1是飽和脂肪烴甲基的伸縮振動(dòng)吸收峰與彎曲振動(dòng)吸收峰，1700cm-1 是羰基的伸縮振動(dòng)吸收峰，1636 cm-1，1564 cm-1，1467 cm-1是苯環(huán)的骨架振動(dòng)吸收峰?；衔?a的紅外圖譜見圖3.7。（2）氯代苯并吡喃甲酸和硝基、3，5-二氯代苯并吡喃甲酸的紅外吸收圖譜分別見圖3.10、3.11、3.12。同時(shí)以氯代苯并吡喃甲酸的紅外吸收圖譜為例證實(shí)

26、酯確實(shí)進(jìn)行了水解，并進(jìn)一步證明了酸的結(jié)構(gòu)。圖3.10氯代苯并吡喃甲酸的紅外吸收圖譜圖3.11硝基苯并吡喃甲酸的紅外吸收圖譜圖3.123,5-二氯苯并吡喃甲酸的紅外吸收圖譜化合物（3a3c）的紅外圖譜分析見表 3.3。表3.3 化合物（3a3c）的紅外圖譜化合物V OH / cm-1V C=C-H/cm-1VAr-H/cm-1VC=O/ cm-1VAr/ cm-13a33693106304316701617 1565 14803b34163089297316791626 1522 14963c34173074295617461634 15621463以（3b）為例進(jìn)行分析：3416cm-1是羥基

27、的伸縮振動(dòng)吸收峰，2956 cm-1, 3074cm-1是苯環(huán)、雙鍵上的C-H伸縮振動(dòng)吸收峰, 1746 cm-1 是羰基的伸縮振動(dòng)吸收峰，1634 cm-1 1562 cm-1 1463 cm-1是苯環(huán)的骨架振動(dòng)吸收峰?；衔?b的紅外圖譜見圖3.11。3.2 苯并吡喃基殼寡糖衍生物的結(jié)構(gòu)表征紫外吸收分析圖3.13殼寡糖(COS) 與苯并吡喃基殼寡糖衍生物的紫外吸收光譜由殼寡糖(COS)及苯并吡喃基殼寡糖衍生物紫外吸收光譜數(shù)據(jù)（表3.4）可以看出：COS在265nm處有1個(gè)強(qiáng)的吸收峰，在大于268nm波長范圍無明顯吸收。苯并吡喃基殼寡糖衍生物在200327nm處各有三個(gè)吸收峰。苯分子在180

28、 184nm,200 204nm有強(qiáng)吸收帶E1和E2帶，在230270有弱吸收帶B帶。由于含有 鍵的生色團(tuán)與苯環(huán)相連，* 共軛使苯環(huán)的三個(gè)吸收峰發(fā)生明顯紅移。紫外圖譜顯示與理論推斷相符。表3.4殼寡糖(COS) 與苯并吡喃基殼寡糖衍生物的紫外吸收光譜數(shù)據(jù)化合物UV/nmUV/nmUV/nm殼寡糖 (COS）265氯代苯并吡喃基殼寡糖322274201硝基代苯并吡喃基殼寡糖3272752023，5-二氯苯并吡喃基殼寡糖334267208從表3.4可以看出，苯并吡喃基殼寡糖衍生物的紫外光譜掃描曲線與殼寡糖（COS）原料的紫外掃描曲線完全不同，這是由于COS與苯并吡喃類衍生物酸及取代苯并吡喃類衍生物

29、酸發(fā)生加成反應(yīng)后的紫外吸收峰與原料殼寡糖相比有了改變。這進(jìn)一步證實(shí)了殼寡糖與苯并吡喃類衍生物酸及取代苯并吡喃類衍生物酸發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)。紅外吸收分析圖3.14是殼寡糖（COS）及苯并吡喃基殼寡糖衍生物的紅外光譜圖，圖3.15、3.16、3.17、3.18分別為殼寡糖的紅外光譜圖、氯代苯并吡喃基殼寡糖的紅外光譜圖、硝基苯并吡喃基殼寡糖的紅外光譜圖、3,5-二氯代苯并吡喃基殼寡糖的紅外光譜圖。在COS的紅外譜圖中，3448cm-1是OH伸縮振動(dòng)，1414 cm-1是苯環(huán)上C-Cl伸縮振動(dòng)，1 722 cm-1是CO伸縮振動(dòng)；在殼寡糖酰胺類衍生物的紅外光譜中，725nm是C-伸縮振動(dòng)，1528 cm-

30、1，1350，1528分別是N=O反對陳伸縮振動(dòng)和對稱伸縮振動(dòng)，1708 1750 cm-1是C=O的伸縮振動(dòng)，并且在1 4501600 cm-1 附近出現(xiàn)了苯環(huán)的特征骨架振動(dòng)吸收峰：氯代苯并吡喃基殼寡糖 1613 cm-1 1523 cm-1 1450 cm-1 ；硝基苯并吡喃基殼寡糖 1617 cm-1 1593 cm-1 1527 cm-1 1473 cm-1；3,5-二氯苯并吡喃基殼寡糖 1625 cm-1 1600 cm-1 1550 cm-11475 cm-1 。這些新峰均是由3種苯并吡喃甲酸與COS反應(yīng)生成的苯并吡喃基殼寡糖衍物所產(chǎn)生的。特別是C-X和-C=O吸收峰的出現(xiàn)，也證實(shí)

31、了制備的酸與殼寡糖發(fā)生了反應(yīng)。圖3.14殼寡糖（COS）及苯并吡喃基殼寡糖衍生物的紅外光譜圖1:殼寡糖 2:氯代苯并吡喃基殼寡糖3:硝基苯并吡喃基殼寡糖4：3,5-二氯苯并吡喃基殼寡糖圖3.15殼寡糖的紅外光譜圖圖3.16 氯代苯并吡喃殼寡糖的紅外光譜圖圖3.17 硝基苯并吡喃基殼寡糖的紅外光譜圖圖3.183,5-二氯苯并吡喃基殼寡糖的紅外光譜圖核磁圖譜分析做核磁氫譜用的溶劑均是DMSO。對比圖譜3.19和3.20，殼寡糖的氫譜圖在7-8ppm處無吸收峰，表明無苯環(huán)的存在。而苯環(huán)硝基苯并吡喃基殼寡糖在之間有多處吸收峰，表明有苯環(huán)骨架的存在，進(jìn)一步證實(shí)了制備的酸與殼寡糖發(fā)生了反應(yīng)。圖3.19 殼

32、寡糖的1H NMR譜（400MHz）圖3.20 硝基苯并吡喃基殼寡糖的1H NMR譜（400MHz）圖3.21 硝基苯并吡喃基殼寡糖的1H NMR譜（400MHz）（局部放大圖）3.3苯并吡喃基殼寡糖衍生物產(chǎn)率計(jì)算苯并吡喃衍生物酸在TBTU為脫水劑乙腈為溶劑的條件下與殼寡糖反應(yīng)得到苯并吡喃基殼寡糖衍生物，根據(jù)投料和產(chǎn)物質(zhì)量可以利用如下公式計(jì)算出各反應(yīng)的產(chǎn)率。公式：其中：m1殼寡糖的質(zhì)量/g；m2產(chǎn)物的質(zhì)量/g； M1殼寡糖結(jié)構(gòu)單元的相對分子質(zhì)量/(g/mol)；M2縮合產(chǎn)物結(jié)構(gòu)單元相對分子質(zhì)量/(g/mol)；目標(biāo)產(chǎn)物氯代苯并吡喃基殼寡糖、硝基代苯并吡喃基殼寡糖、3,5-二氯苯并吡喃基殼寡糖的

33、產(chǎn)率分別為44%、58%、36%。4結(jié)論（1）苯并吡喃酸的合成從三氟乙酰乙酸乙酯和水楊醛/取代水楊醛出發(fā)，在乙醇溶劑及哌啶為催化劑的條件下先合成苯并吡喃類化合物酯，進(jìn)而在含有過量氫氧化鉀的甲醇中進(jìn)行酯水解可以高產(chǎn)率的得到苯并吡喃酸。由于酯在乙醇中有較大的溶解性，故乙醇的加入量對于苯并吡喃酯結(jié)晶的快慢、多少有很大的影響，可以適當(dāng)蒸餾出一定溶劑促使結(jié)晶形成。利用紫外與紅外等表征了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，證實(shí)了反應(yīng)的發(fā)生。（2）苯并吡喃基殼寡糖衍生物的合成在乙腈為溶劑和TBTU為脫水劑下，將水解得到的苯并吡喃酸和殼寡糖在常溫下攪拌反應(yīng)，可以方便的制備苯并吡喃基殼寡糖衍生物。利用紫外、紅外對化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，

34、可以證實(shí)生成了目標(biāo)產(chǎn)物。（4）根據(jù)產(chǎn)率的計(jì)算公式得到的結(jié)果可以初步認(rèn)為、3,5-二氯苯并吡喃基甲酸不易與殼寡糖發(fā)生脫水縮合而氯代苯并吡喃甲酸和硝基代苯并吡喃甲酸則較易反應(yīng)。參考文獻(xiàn)1 Ayers A R, Ebel J, Fineli F, et al. Host-pathogen interactions. Quantitative assays of elicitor activity and characterization of the elicitor present in the extracellular medium of cultures of Phytopotho ra m

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