全內(nèi)反射熒光顯微鏡ppt課件

1、全內(nèi)反射熒光顯微鏡醫(yī)學(xué)實驗05級張園 鄭雪飛 宋一萌 解依荻發(fā)展歷史優(yōu)勢應(yīng)用分型及結(jié)構(gòu)基本原理基本原理發(fā)展與展望發(fā)展與展望發(fā)展歷史 細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質(zhì)進行定性和定量研究的工具之一。 發(fā)展歷史 在細(xì)胞生物學(xué)方面，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡始終不能解決生物樣本顯微中的幾個重要問題： 1.顯微圖像的信噪比不高； 2.光源對生物樣本照射的損傷； 3.光學(xué)衍射所致的分辨極限R 0. 61/nsin）： 傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡由于受到光瞳遠場衍射效應(yīng)的影響,存在分辨極限,瑞利將之

2、歸納為R 0. 61/nsin(u/2) ,其中R為分辨力 ,為成像光波波長, nsin(u/2)為物透鏡的數(shù)值孔徑,即NA 值，u為孔徑角,因此光學(xué)顯微鏡空間分辨極限250 nm。發(fā)展歷史 近年來人們開發(fā)出了一系列光學(xué)顯微鏡。其中，全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)(Total internal reflection fluorescence microscopy ,TIRFM)是近年來新興的一種光學(xué)成像技術(shù)。Hirsch fieldHirsch field完成了完成了第一個第一個全內(nèi)反射全內(nèi)反射熒光實驗熒光實驗19651965年年AxelrodAxelrod等生物物理等生物物理學(xué)家對學(xué)家對TRIFMTRI

3、FM技術(shù)技術(shù)及基本原理進行描及基本原理進行描述，并探索了其生述，并探索了其生物應(yīng)用。物應(yīng)用。 20世世紀(jì)紀(jì)20世世紀(jì)紀(jì)9090年代年代新型物鏡透鏡、聚光新型物鏡透鏡、聚光鏡和超靈敏探測器的鏡和超靈敏探測器的出現(xiàn)，使出現(xiàn)，使TRIFMTRIFM技術(shù)技術(shù)得到充分發(fā)展。得到充分發(fā)展。20192019年年YanagidaYanagida小小組用組用TIRFMTIRFM技技術(shù)首次在液體術(shù)首次在液體溶液中得到了溶液中得到了熒光標(biāo)記的單熒光標(biāo)記的單個蛋白質(zhì)分子個蛋白質(zhì)分子的成像。的成像。該項技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到該項技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到許多單分子的研究中許多單分子的研究中20192019年年MoernerMoerner小

4、組小組又用這項技術(shù)又用這項技術(shù)實現(xiàn)了限制在實現(xiàn)了限制在丙烯酰胺膠體丙烯酰胺膠體的納米孔中的的納米孔中的單分子的三維單分子的三維成像。成像。至今至今基本原理基本原理全內(nèi)反射熒光顯微鏡全內(nèi)反射熒光顯微鏡的基本設(shè)計思路的基本設(shè)計思路全內(nèi)反射熒光顯微鏡全內(nèi)反射熒光顯微鏡的基本原理的基本原理 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)是利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的消逝波激發(fā)樣品,從而使樣品表面數(shù)百納米厚的薄層內(nèi)的熒光團受到激發(fā),熒光成像的信噪比大大提高?？梢钥吹綐悠繁砻?，單分子的活動情況。這種方法的成像裝置簡單，極易和其它成像技術(shù)、探測技術(shù)相結(jié)合，目前已成功的實現(xiàn)100nm甚至更低的空間分辨率?；驹砘驹砣珒?nèi)反射熒光顯微鏡全內(nèi)反射

5、熒光顯微鏡的基本設(shè)計思路的基本設(shè)計思路全內(nèi)反射熒光顯微鏡全內(nèi)反射熒光顯微鏡的基本原理的基本原理熒光激發(fā)原理熒光激發(fā)原理熒光捕捉原理熒光捕捉原理snellsnell定律定律: :n1sin 1=n2 sin 2 n1sin 1=n2 sin 2 當(dāng)n1大于n2時，全反射就可能發(fā)生:2=90 c=sin-1(n2/n1) 即所有的入射光線全部反射出來,稱為全內(nèi)反射熒光激發(fā)原理熒光激發(fā)原理沿著入射面上的介質(zhì)邊界傳播在平行界面方向以平行波場方式傳播在垂直界面方向則是呈指數(shù)衰減。 隱失波的強度-深度圖熒光激發(fā)原理熒光激發(fā)原理非均勻波 T12i）- 分界面處的透射強度分界面處的透射強度d 12 - 滲透深

6、度滲透深度i - 入射角入射角 - 入射光波長入射光波長對于可見光波長380 780nm而言，浸透深度為100nm。熒光激發(fā)原理熒光激發(fā)原理箭頭表示激光的方向，激光被全反射，同時產(chǎn)生在箭頭表示激光的方向，激光被全反射，同時產(chǎn)生在z方向成指數(shù)方向成指數(shù)衰減的隱失波。衰減的隱失波。黃色小圓點表示被隱失波激發(fā)的熒光分子，黃色小圓點表示被隱失波激發(fā)的熒光分子，白色小圓點表示未被激發(fā)的熒光分子。白色小圓點表示未被激發(fā)的熒光分子。熒光捕捉原理熒光捕捉原理CCD相機 CCD相機的高靈敏度特點使全內(nèi)反射熒光顯微鏡利用消逝波照射樣品并使其成像成為可能，也成就了其高信噪比。 CCD相機的快速成像特點提高了其時間分

7、辨率，使得觀察單分子的運動、細(xì)胞物質(zhì)的分泌、蛋白質(zhì)的相互作用成為可能并成為這方面的優(yōu)勢觀察儀器。 目前使用CCD 探測,可達到的量子產(chǎn)率已到80 % ,成像速率200 Hz.當(dāng)對活細(xì)胞成像時,為了達到單分子級的靈敏度或是為了減少曝光時間,需要采用圖像增強器。熒光捕捉原理熒光捕捉原理兩種類型的全內(nèi)反射熒光顯微鏡成像系統(tǒng)，1為棱鏡型，2為物鏡型。 棱鏡型系統(tǒng)在實現(xiàn)上更加容易，它只需要激光光源、棱鏡和顯微鏡。在探測上，它也不容易受到入射光信號的干擾。放置樣品的空間受到棱鏡的限制。棱鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡 物鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡利用物鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡觀察活細(xì)胞表面示意圖。 The applic

8、ation of the total internal reflection fluorescence microscopy解依荻全內(nèi)反射應(yīng)用的核心問題全內(nèi)反射應(yīng)用的核心問題l全內(nèi)反射應(yīng)用的核心問題是制作與電子顯微術(shù)EM切片尺寸相當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)切片。共焦技術(shù)共焦技術(shù) VS.VS.全內(nèi)反射技術(shù)全內(nèi)反射技術(shù)l共焦技術(shù)：單光子或雙光子的共焦系統(tǒng)層析深度分別為500800nm。l全內(nèi)反射顯微術(shù): 典型的垂直照明深度100nm。l結(jié)論：薄的光學(xué)層析層切片信噪比強；l 細(xì)胞的光損傷和光漂白影響也很小。全內(nèi)反射的應(yīng)用全內(nèi)反射的應(yīng)用l在生物單分子研究中的應(yīng)用l直接觀察細(xì)胞表面的生命活動,而不受細(xì)胞深層區(qū)域信號的干擾

9、.l全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)的熒光激發(fā)深度只在200的薄層范圍內(nèi),從而成為研究細(xì)胞表面科學(xué)如生物化學(xué)動力學(xué)、單分子動力學(xué)的最有前途的光學(xué)成像技術(shù)。全內(nèi)反射的應(yīng)用比較全內(nèi)反射的應(yīng)用比較l與其他生物單分子研究技術(shù)的比較l全內(nèi)反射熒光顯微鏡TIRFM）l共聚焦激光掃描顯微鏡CLSM）l雙光子激光掃描顯微鏡TPLSM）全內(nèi)反射的應(yīng)用比較全內(nèi)反射的應(yīng)用比較全內(nèi)反射的應(yīng)用比較全內(nèi)反射的應(yīng)用比較生物單分子熒光檢測技術(shù)的比較生物單分子熒光檢測技術(shù)的比較共聚焦激光掃描顯微（CLSM）雙光子激光掃描顯微鏡（TPLSM）全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRFM）共同點檢測細(xì)胞熒光物質(zhì)的技術(shù)空間分辨熒光分析技術(shù)區(qū)別點CLSM提供了僅

10、從單光學(xué)薄層收集光波的可能性。與聚焦平面共軛的針孔定位（即共焦）可避免來自檢測器之外的光，即從聚焦平面以外的其它地方反射/發(fā)射過來的光。不要求高于衍射極限的分辨率 TPLSM對生物系統(tǒng)和體內(nèi)細(xì)胞性質(zhì)具有高的分辨率。雙光子激發(fā)能探索活細(xì)胞內(nèi)各種分子的實時動態(tài)，能實現(xiàn)在樣品中的高度精確定位。減少了光損傷，特別對需要條件溫和的生物體系有利TIRFM具有高度的界面（表面）特異性，可有效排除本體干擾，獲取界面信息?？v向分辨力極高，特別適用于表面或界面單分子的測定。全內(nèi)反射熒光法相對簡單，費用低廉。表面或界面單分子的測定展望前景展望前景l(fā)不論是對物理成像學(xué)家還是對細(xì)胞生物學(xué)家而言，全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)均是一

11、項新的技術(shù)。它的未來發(fā)展將是怎樣的呢？l它將向著兩個前沿方向發(fā)展：技術(shù)上的進一步創(chuàng)新和在新的細(xì)胞生命科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。這意味著在一方面全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)將繼續(xù)和其它的顯微成像技術(shù)，如熒光相關(guān)光譜技術(shù)，熒光壽命成像技術(shù)以及原子力顯微術(shù)相結(jié)合；另一方面，繼續(xù)尋求成像原理上的突破，這也正是目前有待積極探索的課題。全內(nèi)反射熒光顯微鏡的改進全內(nèi)反射熒光顯微鏡的改進1. 光電探測設(shè)備探測效率和探測速度的提高新型的物鏡透鏡、聚光器和其它材料的引入2. 單分子染色技術(shù)的發(fā)展新型的物鏡透鏡、聚光器和其它新型的物鏡透鏡、聚光器和其它材料的引入材料的引入l超高的信噪比，能夠得到完美的超高的信噪比，能夠得到完美的圖像

12、圖像l嶄新的嶄新的UIS2物鏡的信噪比優(yōu)越，物鏡的信噪比優(yōu)越，高于現(xiàn)有物鏡高于現(xiàn)有物鏡50%。這種物鏡的。這種物鏡的新特性還包括精選了低自發(fā)熒光新特性還包括精選了低自發(fā)熒光玻璃通過全反射鍍膜和連接材玻璃通過全反射鍍膜和連接材料，顯著減少了自發(fā)熒光），提料，顯著減少了自發(fā)熒光），提高了數(shù)值孔徑，增強了信號亮度。高了數(shù)值孔徑，增強了信號亮度。UIS2系統(tǒng)在弱激發(fā)光下，能夠有系統(tǒng)在弱激發(fā)光下，能夠有效探測極弱熒光，從而建立了活效探測極弱熒光，從而建立了活細(xì)胞熒光成像的新標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞熒光成像的新標(biāo)準(zhǔn)。 新型的物鏡透鏡、聚光器和其它新型的物鏡透鏡、聚光器和其它材料的引入材料的引入擁有更寬波長范圍內(nèi)的高透過

13、率擁有更寬波長范圍內(nèi)的高透過率內(nèi)置物鏡采用內(nèi)置物鏡采用UW多層鍍膜技術(shù)，能多層鍍膜技術(shù)，能有效消除超寬譜帶上的反射，在可有效消除超寬譜帶上的反射，在可見光到近紅外光的波長范圍內(nèi)能夠見光到近紅外光的波長范圍內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)平坦的高透過率，在近紅外和實現(xiàn)平坦的高透過率，在近紅外和紫外范圍內(nèi)的透過率顯著提高。提紫外范圍內(nèi)的透過率顯著提高。提高較寬波長范圍內(nèi)的性能使它非常高較寬波長范圍內(nèi)的性能使它非常適合當(dāng)今最需要的研究用途。適合當(dāng)今最需要的研究用途。 新型的物鏡透鏡、聚光器和其它新型的物鏡透鏡、聚光器和其它材料的引入材料的引入l有效消除直到近紅外范圍的色差有效消除直到近紅外范圍的色差l杰出的超級復(fù)消色差特

14、點有效地消除了杰出的超級復(fù)消色差特點有效地消除了從可見光譜直到從可見光譜直到1000nm1000nm范圍內(nèi)的色差范圍內(nèi)的色差, , 意味著從紫外到紅外范圍內(nèi)的成像都可意味著從紫外到紅外范圍內(nèi)的成像都可以只用一個物鏡實現(xiàn)。這一系列物鏡在以只用一個物鏡實現(xiàn)。這一系列物鏡在使用覆蓋很寬譜帶的熒光進行多色觀察使用覆蓋很寬譜帶的熒光進行多色觀察時，可以獲得出色的清晰圖像而不產(chǎn)生時，可以獲得出色的清晰圖像而不產(chǎn)生顏色偏移。顏色偏移。 新型的物鏡透鏡、聚光器和其它新型的物鏡透鏡、聚光器和其它材料的引入材料的引入l雙層多光口設(shè)計保證了輸入雙層多光口設(shè)計保證了輸入/ /輸出靈活性輸出靈活性l 新型的物鏡透鏡、聚

15、光器和其它新型的物鏡透鏡、聚光器和其它材料的引入材料的引入l后上光口后上光口l后上光口不改變載物臺高度，所以不影響鏡架穩(wěn)定性后上光口不改變載物臺高度，所以不影響鏡架穩(wěn)定性這一光口可做光路輸入口，可裝一個附加熒光照明器這一光口可做光路輸入口，可裝一個附加熒光照明器 l右側(cè)光口右側(cè)光口l右側(cè)光口裝置右側(cè)光口裝置IX2-RSPC-2:可選件，視場數(shù)：可選件，視場數(shù)：16帶有一個結(jié)像透帶有一個結(jié)像透鏡，可以安裝一個鏡，可以安裝一個C型接口型接口CCD照相機。照相機。l后下光口后下光口l能夠安裝冷能夠安裝冷CCD DP30BW與同類設(shè)備。與同類設(shè)備。 l左側(cè)光口左側(cè)光口l在這一光口上，原始圖像平面距顯微

16、鏡鏡架在這一光口上，原始圖像平面距顯微鏡鏡架102mm，具有很大的靈，具有很大的靈活性，用以安裝濾色鏡轉(zhuǎn)盤或者超低活性，用以安裝濾色鏡轉(zhuǎn)盤或者超低0.25X或或5X照相機適配器。照相機適配器。與雙光口視頻適配器結(jié)合，能夠獲得兩個原始圖像。（可選件）與雙光口視頻適配器結(jié)合，能夠獲得兩個原始圖像。（可選件） l底光口底光口使用使用IX2-TVR （T型接口），獲得原始圖像。型接口），獲得原始圖像。 新型的物鏡透鏡、聚光器和其它新型的物鏡透鏡、聚光器和其它材料的引入材料的引入l提高了近紅外透過率提高了近紅外透過率lIX2IX2系列采用系列采用UIS2 UIS2 光學(xué)系統(tǒng)，提高了側(cè)光光學(xué)系統(tǒng)，提高了側(cè)光口、后光口和底光口的紅外透過率，能口、后光口和底光口的紅外透過率，能夠提供多方面的高性能，以適應(yīng)未來研夠提供多方面的高性能，以適應(yīng)未來研究的需