第二章 DNA復(fù)制

1、DNA 復(fù) 制、損傷與修復(fù)n本章主要內(nèi)容：本章主要內(nèi)容： 復(fù)制的基本規(guī)律復(fù)制的基本規(guī)律 DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化 復(fù)制的過程復(fù)制的過程 逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式 DNA損傷（突變）與修復(fù)損傷（突變）與修復(fù)第一節(jié)第一節(jié) DNA 復(fù)制復(fù)制復(fù)制復(fù)制(replication) 是指遺傳物質(zhì)的傳代，是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈以母鏈DNA為模板合成子鏈為模板合成子鏈DNA的過程。的過程。復(fù)制復(fù)制親代親代DNA子代子代DNA一、一、DNA的復(fù)制的復(fù)制DNA DNA 復(fù)復(fù) 制制 的的 基基 本本 特特 征征n半保留復(fù)制半保留復(fù)制: :AGGTACTGCCACTGGTC

2、CATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈母鏈DNA復(fù)制過程中形成復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉的復(fù)制叉子代子代DNAn子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式: : 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 n密度梯度實(shí)驗(yàn)密度梯度實(shí)驗(yàn): : 實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。含重氮含重氮-DNA的細(xì)菌的細(xì)菌培養(yǎng)于普培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液通培養(yǎng)液

3、第一代第一代繼續(xù)培養(yǎng)于繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液普通培養(yǎng)液 第二代第二代梯度離心結(jié)果梯度離心結(jié)果按半保留復(fù)制方式，子代按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代與親代DNA A的的堿基序列一致堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性保守性。n半保留復(fù)制的意義半保留復(fù)制的意義: :遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但但不是絕對的不是絕對的。復(fù)制中的放射自顯影圖像復(fù)制中的放射自顯影圖像A. 環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)及復(fù)制起始點(diǎn)B. 復(fù)制中的兩個復(fù)制叉復(fù)制中的兩個復(fù)制叉C. 復(fù)制接近終止點(diǎn)復(fù)制

4、接近終止點(diǎn)(termination, ter)oriterA B C53oriorioriori5353oriorioriori535533553復(fù)制復(fù)制33 5 3 5 解鏈方向解鏈方向3 5 3 3 5 前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈(leading strand)后隨鏈后隨鏈(lagging strand) 順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為這股鏈稱為前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈(leading strand) 。 另一股鏈因?yàn)閺?fù)制的方向與解鏈方向相反，不另一股鏈因?yàn)閺?fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股

5、不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為鏈稱為后隨鏈后隨鏈(lagging strand) 。復(fù)制中的不連。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為續(xù)片段稱為岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。 前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而連續(xù)復(fù)制而后隨鏈后隨鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的制的半不連續(xù)性半不連續(xù)性。 n參與參與DNA復(fù)制的物質(zhì)復(fù)制的物質(zhì): 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP； 聚合酶聚合酶(polymerase): 依賴依賴DNA的的DNA聚合酶，聚合酶，簡寫為簡寫為 DNA-pol； 模板模板(template): 解開成單鏈的解開成單鏈的DNA母鏈；母鏈； 引物

6、引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次可以依次聚合；聚合； 其他的酶和蛋白質(zhì)因子。其他的酶和蛋白質(zhì)因子。二、二、DNA復(fù)制的酶學(xué)復(fù)制的酶學(xué)一、核苷酸和核苷酸之間生成磷酸二酯鍵一、核苷酸和核苷酸之間生成磷酸二酯鍵是復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng)是復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng)(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi5 5-末端末端3 3-末端末端CGA磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵DNADNA鏈的方向是鏈的方向是5 5 3 3 活性：活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3

7、 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性: 5 3 外切酶活性外切酶活性:?能切除突變的能切除突變的 DNA片段。片段。能辨認(rèn)錯配的堿基對，并將其水解。能辨認(rèn)錯配的堿基對，并將其水解。n核酸外切酶活性核酸外切酶活性: : （一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶分為三型聚合酶分為三型 DNA-pol DNA-pol DNA-pol 原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶可能可能不可能不可能可能可能基因突變后的致死性基因突變后的致死性無無無無有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性2

8、0？400分子數(shù)分子數(shù)/細(xì)胞細(xì)胞多亞基不對稱多亞基不對稱二聚體二聚體？單肽鏈單肽鏈組成組成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I可能可能不可能不可能可能可能基因突變后的致死性基因突變后的致死性無無無無有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子數(shù)分子數(shù)/細(xì)胞細(xì)胞多亞基不對稱多亞基不對稱二聚體二聚體？單肽鏈單肽鏈組成組成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol In功能：功能： DNA-pol （109kD）對復(fù)制中的錯誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制和修復(fù)對復(fù)制中的錯誤進(jìn)行校讀，對復(fù)

9、制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。323個氨基酸個氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604個氨基酸個氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。 DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活?；虬l(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。 DNA-pol 對模板的特異性不高，即使在已發(fā)生對模板的特異性不高，即使

10、在已發(fā)生損傷的損傷的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此認(rèn)為，它參與此認(rèn)為，它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。n功能：功能： DNA-pol (250kD)是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。（二）常見的真核細(xì)胞（二）常見的真核細(xì)胞DNA聚合酶有五種聚合酶有五種DNA-pol 起始引發(fā)，有引物酶活性。起始引發(fā)，有引物酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。在真核生物在真核生物DNADNA鏈延長中起催化作用鏈延長中起催化作用，相當(dāng)于原核生物的，相當(dāng)于原核生物的DN

11、A-pol 參與低保真度的復(fù)制參與低保真度的復(fù)制 。在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用?？诘淖饔?。在線粒體在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。復(fù)制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶填填補(bǔ)補(bǔ)引引物物空空隙隙，切切除除修修復(fù)復(fù)，重重組組延延長長子子鏈鏈的的主主要要酶酶，解解螺螺旋旋酶酶活活性性線線粒粒體體DNA復(fù)復(fù)制制低低保保真真度度的的復(fù)復(fù)制制起起始始引引發(fā)發(fā)，引引物物酶酶活活性性功功能能+-3 5 核核酸酸外外切切酶酶活活性性高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性25.512

12、.514.04.016.5分分子子量量（kD）DNA-pol填填補(bǔ)補(bǔ)引引物物空空隙隙，切切除除修修復(fù)復(fù)，重重組組延延長長子子鏈鏈的的主主要要酶酶，解解螺螺旋旋酶酶活活性性線線粒粒體體DNA復(fù)復(fù)制制低低保保真真度度的的復(fù)復(fù)制制起起始始引引發(fā)發(fā)，引引物物酶酶活活性性功功能能+-3 5 核核酸酸外外切切酶酶活活性性高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性25.512.514.04.016.5分分子子量量（kD）DNA-pol三、核酸外切酶的校讀活性和堿基選擇三、核酸外切酶的校讀活性和堿基選擇功能是復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù)功能是復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù) 復(fù)制按照堿基配對規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能復(fù)制按照堿基配對

13、規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn)確傳代的基本原理。準(zhǔn)確傳代的基本原理。 此外還需酶學(xué)的機(jī)制來保證復(fù)制的保真性。此外還需酶學(xué)的機(jī)制來保證復(fù)制的保真性。A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。性摻入正確配對的底物。B：堿基配對正確，：堿基配對正確， DNA-pol不表現(xiàn)活性。不表現(xiàn)活性。DNA pol 的校讀功能的校讀功能遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；聚合酶在復(fù)制延長時對堿基的選擇功能；聚合酶在復(fù)制延長時對堿基的選擇功能；復(fù)制出錯時復(fù)制出錯時DNA-pol的及時校讀功能。的及時校讀功能。nDNA復(fù)制的保真性至少要

14、依賴復(fù)制的保真性至少要依賴 三種機(jī)制：三種機(jī)制：四、復(fù)制中的分子解鏈伴有四、復(fù)制中的分子解鏈伴有DNA 分子拓?fù)鋵W(xué)變化分子拓?fù)鋵W(xué)變化DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。解成單鏈，它才能起模板作用。（一）多種酶參與（一）多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)理理順順DNA鏈鏈拓拓?fù)鋼洚惍悩?gòu)構(gòu)酶酶 (gyrA, B)穩(wěn)穩(wěn)定定已已解解開開的的單單鏈鏈單單鏈鏈DNA結(jié)結(jié)合合蛋蛋白白SSB催催化化RNA引引物物生生成成引引物物酶酶DnaG (dnaG)運(yùn)運(yùn)送送和和協(xié)協(xié)同同DnaBDnaC (dnaC)解解開開DNA雙雙鏈鏈

15、解解螺螺旋旋酶酶DnaB (dnaB)辨辨認(rèn)認(rèn)起起始始點(diǎn)點(diǎn)DnaA (dnaA)蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)（基基因因）通通用用名名功功能能原原核核生生物物復(fù)復(fù)制制起起始始的的相相關(guān)關(guān)蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)解螺旋酶解螺旋酶(helicase)利用利用ATP供能，作用于供能，作用于氫鍵，使氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。雙鏈解開成為兩條單鏈。引物酶引物酶(primase) 復(fù)制起始時催化生成復(fù)制起始時催化生成RNA引物的酶。引物的酶。單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整

16、態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。 108局部解鏈后局部解鏈后（二）（二）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶改變拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA超螺旋狀態(tài)、超螺旋狀態(tài)、理順理順DNA鏈鏈n復(fù)制過程正超螺旋的形成：復(fù)制過程正超螺旋的形成：解鏈過程中正超螺旋的形成解鏈過程中正超螺旋的形成 既能水解既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵。、又能連接磷酸二酯鍵。 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶n拓?fù)洚悩?gòu)酶分類：拓?fù)洚悩?gòu)酶分類：n拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)：拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)：拓?fù)洚愅負(fù)洚悩?gòu)酶構(gòu)酶切斷切斷DNA雙鏈中雙鏈中一股一股鏈，使鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時候封解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時候封閉切口，閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反

17、應(yīng)反應(yīng)不需不需ATP。拓?fù)洚愅負(fù)洚悩?gòu)酶構(gòu)酶切斷切斷DNA分子分子兩股兩股鏈，斷端通過鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，連接斷端，供能，連接斷端， DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。n作用機(jī)制：作用機(jī)制：n拓?fù)涿傅淖饔梅绞剑和負(fù)涿傅淖饔梅绞剑何濉⑽?、DNA連接酶連接連接酶連接DNA雙鏈中的雙鏈中的單鏈缺口單鏈缺口連接連接DNA鏈鏈3 -OH末端和相鄰末端和相鄰DNA鏈鏈5 -P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。鏈連接成一條完整的鏈。n DNA連接酶連接酶(D

18、NA ligase)作用方式：作用方式：POO-O-OHO5POO-O-O335DNA連接酶連接酶ATPADP5353nDNA連接酶的作用：連接酶的作用： DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。作用。 在在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用?？谧饔?。 也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。n功能：功能：提供核糖提供核糖3 -OH提供提供5 -P結(jié)果結(jié)果DNA聚合酶聚合酶引物或延長中的引物或延長中的新鏈新鏈游離游離dNTP去去PPi(dNTP)n+1連接酶連接酶復(fù)制中不連續(xù)的兩條單鏈復(fù)制中不連續(xù)的兩條單鏈不

19、連續(xù)不連續(xù)連續(xù)鏈連續(xù)鏈拓?fù)涿竿負(fù)涿盖袛唷⒄砗蟮膬涉溓袛?、整理后的兩鏈改變拓?fù)錉顟B(tài)改變拓?fù)錉顟B(tài)DNA聚合酶，拓?fù)涿负瓦B接酶催化聚合酶，拓?fù)涿负瓦B接酶催化3 ,5 -磷酸二酯鍵生成的比較磷酸二酯鍵生成的比較（一）復(fù)制起始：（一）復(fù)制起始：DNA解鏈形成引發(fā)體解鏈形成引發(fā)體需要解決兩個問題：需要解決兩個問題：1. DNA解開成單鏈，提供模板。解開成單鏈，提供模板。2. 形成引發(fā)體，合成引物，提供形成引發(fā)體，合成引物，提供3 -OH末端。末端。三、原核生物的三、原核生物的DNA生物合成生物合成E.coli復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn) oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCT

20、CTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串聯(lián)重復(fù)序列串聯(lián)重復(fù)序列 反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列5 3 5 3 1. DNA解鏈解鏈 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 2. 引發(fā)體和引物引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。

21、復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短鏈引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。分子。引物引物3 HO5引物引物酶酶（二）復(fù)制的延長過程：前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制，（二）復(fù)制的延長過程：前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制，后隨鏈不連續(xù)復(fù)制后隨鏈不連續(xù)復(fù)制復(fù)制的延長指在復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-poln前導(dǎo)

22、鏈的合成：前導(dǎo)鏈的合成：前導(dǎo)鏈的子鏈沿著前導(dǎo)鏈的子鏈沿著5 5 33 方向可以連續(xù)地延長。方向可以連續(xù)地延長。n后隨鏈的合成后隨鏈的合成n同一復(fù)制叉上前導(dǎo)鏈和后隨鏈由相同的同一復(fù)制叉上前導(dǎo)鏈和后隨鏈由相同的DNA-pol催化延長催化延長 階段一階段一階段二階段二階段三階段三階段四階段四復(fù)復(fù)制制過過程程簡簡圖圖 原核生物基因是環(huán)狀原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。處匯合。oriter E.coli8232 ori terSV40500（三）復(fù)制的終止過程：切除引物、填補(bǔ)（三）復(fù)制的終止過程：切除引物、填補(bǔ)空缺、連接切口空

23、缺、連接切口5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA連接酶連接酶n 隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接：隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接：（一）真核生物復(fù)制的起始與原核基本相似（一）真核生物復(fù)制的起始與原核基本相似3 5 5 3 領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈3 5 3 5 親代親代DNA隨從鏈隨從鏈引物引物核小體核小體n真核生物復(fù)制叉的延長：真核生物復(fù)制叉的延長： 染色體染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。呈線狀，復(fù)制在末端停止。復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。染色體兩端染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，引物，去除后留下空隙。去除后留下空隙。（三）端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制問題（三）端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制問題5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 n線性線性DNA復(fù)復(fù)制的末端制的末端 端粒端粒(telomere) 指真核生物染色體線性指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。分子末端的結(jié)構(gòu)。n端粒的功能：端粒的功能：維持染色體的穩(wěn)定性維持染色體的穩(wěn)定性維持維持DNA復(fù)制的完整性復(fù)制的完整性n端粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：端粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：由末端單鏈由末端單鏈D