微生物工業(yè)化步驟

1、Clostridium ljungdahlii 菌種發(fā)酵實驗工作計劃一、菌種活化菌種活化包含兩步。首先是菌種復蘇，就是使處于保藏（休眠）狀態(tài)的菌 種蘇醒過來，恢復在一定培養(yǎng)條件下的生長代謝能力；活化是在菌種復蘇的基 礎上，通過在適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進行連續(xù)傳代培養(yǎng)來恢復和增強菌種 的活力。實際上菌種活化過程就是菌種復壯的過程，菌種發(fā)酵有一般需要2-3代的復壯過程，因為保存時的條件往往和培養(yǎng)時的條件不相同，所以要活化,讓菌種逐漸適應培養(yǎng)環(huán)境。我們實驗室菌種的保藏條件為-80 °C冰箱凍結法。適用的復蘇方式為：從冰 箱中取出凍存管，立即放置38 C-40 C水浴中快速復蘇并適當快速搖

2、動。 直到內 部結冰全部溶解為止， 約需 50 秒-100 秒。開啟凍存管， 將內容物移至適宜的培 養(yǎng)基上進行培養(yǎng)?？傮w來講菌種活化需要以下幾個步驟1配置菌種適宜生長的培養(yǎng)基；2將冷凍的菌種解凍，使菌種從保藏狀態(tài)恢復到室溫狀態(tài)；3將通過操作將保藏的菌種接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)，此步驟稱為菌種復壯4挑選培養(yǎng)基茁壯的菌落，挑選其中部分菌落接種到新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 重復此步驟 2-3 次，從而得到生長良好的菌落經過這四個步驟就到達將菌種從保藏狀態(tài)活化的目的二、菌種鑒定菌種鑒定的目的是判斷菌種是不是我們所需要的東西， 包括種的鑒定和生產 水平鑒定。1種的鑒定如果是比較熟悉的菌種就可以用常規(guī)鑒定，根據菌種的形

3、態(tài)特征（顯微形 態(tài)和培養(yǎng)特征）理化特性（營養(yǎng)類型、碳氮源利用能力、代謝反應等）做出判 斷。不熟悉的菌種就得用分子生物學方法來鑒定。2生產水平鑒定菌種復壯后需要對生產能力進行判斷。 生化指標：可以通過其生長代謝過程中某些原材料的消耗量和中間代謝物的產量作為指標，或者是這個菌株產生的酶或者是這個菌株產生的次生代謝物。 生理指標：菌株如果復壯成功，他的生長量就會恢復到原來的水平或者更高。 特殊指標：能夠利用特殊物質作為生長必須物質的菌株， 比如Clostridium jungdahlii菌株能夠利用CO CO和H2,可以在搖瓶內通入 CO CO和H2進行培 養(yǎng)，判斷其是否能夠正常生長代謝。三、菌種保

4、藏菌種保藏，是指為了使優(yōu)良菌種的性狀得以保持穩(wěn)定，人為地創(chuàng)造條件， 使菌種的新陳代謝活動處于不活潑狀態(tài)，即選取優(yōu)良菌種的休眠體（孢子或 芽孢）或富有生命力的懸浮液在低溫或脫水狀態(tài)下保存。低溫保存 簡單保存法，將瓊脂斜面孢子培養(yǎng)物、 菌絲懸浮液4C冰箱保存，保存時 間不超過12個月； 液氮超低溫保存法， 將生長穩(wěn)定期的細胞懸浮在 10%甘油或其他低冰點 液體中，密封于安瓿管內，然后控制冷卻速度，使安瓿管溫度逐步下降至-35 C時，即可置于-150-196C的液氮罐中保存。大多數微生物如病毒、噬 菌體、多種細菌、放線菌、酵母和原蟲、特別是一些用冷凍干燥法有困難的 微生物，都可用此法長期保存。脫水保

5、存 冷凍干燥法 ,將孢子懸浮液與保護劑（一般用脫脂牛奶或血清）相混合， 放在安瓿管內于-20-30 C的乙醇浴中速凍。然后，在低溫下用真空泵抽干， 并用五氧化二磷或干冰使水汽結凍，熔封安瓿管，于低溫下保存。保存期可 達 5 10 年之久。 石蠟油封存法，在斜面菌種培養(yǎng)物上，倒上滅菌后的石蠟油，高出斜面1cm，于4C冰箱或低溫干燥處保存，此法不適用于能利用石蠟油作碳源的微 生物，保存期為一年以上。四、菌種的代謝特點 在菌種活化和種子制備擴大培養(yǎng)的同時要注意觀察和總結菌種的生理代謝特征，以便為進一步實驗放大提供依據。 這些特征包括： 培養(yǎng)基種類和用量 （配 置濃度）、酸堿度的喜好、溫度壓力的適應性

6、等。五、種子制備 種子制備，是指菌種在一定條件下，經過擴大培養(yǎng)成為具有一定數量和質量的純生產菌種的制備過程。以作接入發(fā)酵罐中進一步擴大菌體量及合成 產物之用。 Clostridium ljungdahlii 菌種宜采用搖瓶液體培養(yǎng)制得菌絲體，作為 下一工序的種子。作為種子必須具備以下幾個方面條件：生命旺盛有活力，移種至下一 工序后能迅速是在，縮短延遲期；菌體總量適宜，保證接種量；生理狀 態(tài)穩(wěn)定；無雜菌；保持穩(wěn)定生產能力。六、種子培養(yǎng)基的優(yōu)化以提高菌種生產能力、簡化培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)基成分替代、降低生產成本 為目的對種子培養(yǎng)基進行優(yōu)化。七、搖瓶實驗在搖瓶規(guī)模上進行菌種的發(fā)酵培養(yǎng)實驗，為放大積累經驗數據。八、發(fā)酵工藝優(yōu)化、放大以最終實現工業(yè)化生產為目的，在搖瓶實驗積累的數