加味補(bǔ)肝湯對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中蛋白激酶Cβ亞型表達(dá)的影響

1、加味補(bǔ)肝湯對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中蛋白激酶C亞型表達(dá)的影響         11-05-05 11:16:00     編輯：studa20                 作者：傅擎宇,黃娟,陳澤奇,熊麗麗【摘要】  目的 觀察加味補(bǔ)肝湯對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中蛋白激酶C亞型(PKC-)mRNA表達(dá)的影響,探討

2、其對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變的防治作用。方法 65只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)取20只為正常組,45只造模,以鏈脲佐菌素誘發(fā)糖尿病模型,將造模成功后的40只大鼠隨機(jī)分為模型組、加味補(bǔ)肝湯組。分別于治療后4、8周處死大鼠,用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)測(cè)定坐骨神經(jīng)中PKC- mRNA的表達(dá)。結(jié)果 治療后4、8周模型組大鼠PKC- mRNA表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P0.05),加味補(bǔ)肝湯組PKC- mRNA表達(dá)明顯低于同期模型組(P0.05)。結(jié)論 加味補(bǔ)肝湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變有一定的防治作用。 【關(guān)鍵詞】  加味補(bǔ)肝湯；糖尿??；坐骨神經(jīng)；蛋白激酶C亞型；大鼠

3、    Abstract：Objective To observe the effect of Jiawei Bugan decoction on PKC- expression of sciatic nerve in experimental diabetic rat and explore its preventive and therapeutic effects on peripheral neuropathy in experimental diabetic rats. Methods In 65 rats involved, 45 rats were

4、made as model and 20 were used as control. The diabetic rat model was established by streptozotocin (STZ). Forty model rats were randomly divided into model group and Jiawei Bugan decoction group. The rats were killed on 4th or 8th week from the beginning of treatment respectively, and PKC- mRNA of

5、sciatic nerve was detected by reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Results PKC- expression of the model group on 4th or 8th week was higher than that of the normal control group (P0.05), while that of Jiawei Bugan decoction group were markedly lower than the model group (P0.05).

6、 Conclusion Jiawei Bugan decoction has preventive and therapeutic effect on peripheral neuropathy in experimental diabetic rats.    Key words：Jiawei Bugan decoction；diabetes；sciatic nerve；protein kinase c-；rat     糖尿病周圍神經(jīng)病變(DNP)是目前糖尿病患者致殘的主要原因。大量研究表明,蛋白激酶C信號(hào)傳導(dǎo)通路與糖尿

7、病微血管并發(fā)癥發(fā)生相關(guān),尤其與蛋白激酶C亞型(PKC-)關(guān)系更為密切1。目前已闡明,該通路在糖尿病視網(wǎng)膜病變及腎病發(fā)展中起重要作用2,但糖尿病神經(jīng)組織中的情況仍存在爭(zhēng)議。為此,筆者觀察了PKC-在實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠2個(gè)月坐骨神經(jīng)的表達(dá)變化情況及中藥湯劑加味補(bǔ)肝湯對(duì)其的影響,探討其對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變的防治作用。1  實(shí)驗(yàn)材料1.1  動(dòng)物    8周齡清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠65只,體重250280 g,上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,許可證號(hào)SCXK(滬) 2003-003。1.2  藥物  &

8、#160; 加味補(bǔ)肝湯(枸杞子15 g,木瓜15 g,當(dāng)歸10 g,川芎10 g,熟地黃12 g,白芍15 g,桑寄生15 g,麥冬15 g,花粉15 g),中藥飲片由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥劑科提供。中藥飲片加水300 mL,浸泡30 min,水煎40 min,第2次煎時(shí)加水200 mL,煎煮20 min,取煎汁,混勻,水浴濃縮成每1 mL含2.72 g原藥材的藥液。1.3  儀器    TC-512型PCR儀(英國TECHNE公司)；血糖儀(德國羅氏公司ACCU-CHEK)；Motic2000圖像分析儀；MS302多媒體生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)(廣州中醫(yī)藥大學(xué)

9、)。1.4  試劑    瓊脂糖(北京鼎國公司)；溴化乙錠、鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)；Trizol(MRC公司)；反轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒(美國MRI公司)；Pre Mix Taq(寶生物大連有限公司)；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；其他常規(guī)試劑由湘雅醫(yī)院藥劑科提供。2  實(shí)驗(yàn)方法2.1  分組    65只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)取20只為正常組,45只造模,將造模成功后的40只大鼠隨機(jī)分為模型組20只,加味補(bǔ)肝湯實(shí)驗(yàn)組20只。2組血糖值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.2 

10、 造模及給藥    參照文獻(xiàn)3方法。造模前禁食12 h,一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素(50 mg/kg,0.1 mol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液配制而成,pH4.24.5)誘發(fā)糖尿病,72 h后用血糖儀測(cè)定尾尖血血糖,凡血糖16.7 mmol/L為造模成功,造模不成功的大鼠按上述方法重復(fù)1次。正常組20只大鼠禁食12 h后一次性腹腔注射相等容積0.1 mol/L的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。2.3  血糖測(cè)定    尾靜脈取血,采用葡萄糖氧化酶法,羅氏公司ACCU-CHEK血糖儀及試紙條測(cè)定。2.4  神經(jīng)電生理檢測(cè)&

11、#160;   參照文獻(xiàn)4方法并略加改進(jìn),分別于治療后4、8周末進(jìn)行神經(jīng)電生理檢測(cè)。大鼠一次性腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg),麻醉后俯臥固定,刺激電極置于坐骨切跡(刺激強(qiáng)度2.0 mV,刺激波寬3.0 ms),在踝部(遠(yuǎn)端)和右足二趾間分別插入記錄電極,參考電極置于記錄電極和刺激電極之間,并連接計(jì)算機(jī)MS302多媒體生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng),記錄遠(yuǎn)近端坐骨神經(jīng)產(chǎn)生動(dòng)作電位的潛伏期,測(cè)定兩記錄電極間的距離,神經(jīng)傳導(dǎo)速度為記錄電極之間的距離/動(dòng)作電位潛伏期之差。測(cè)定時(shí)保持被檢測(cè)肢體溫度在37 左右。     11-05-05 1

12、1:16:00     編輯：studa202.5  標(biāo)本收集    分別于治療后4、8周一次性腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉,俯臥位固定,取左側(cè)梨狀肌下緣坐骨神經(jīng)約1 cm,置于液氮中,-80 保存,用于mRNA檢測(cè)。2.6  反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)    引物合成：用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,由上海生工生物技術(shù)有限公司合成(見表1)。表1  目的基因擴(kuò)增引物序列（略）    

13、0; 組織總RNA提取：采用Trizol提取總RNA。按Trizol試劑說明書提取總RNA,溶解于20 L DEPC處理滅菌雙蒸水,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性,并測(cè)定A260/A280比值在1.82.0之間,說明RNA樣品純度理想；于-70 凍存。    反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)：cDNA的合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作：總RNA 2 L(約0.5 g),Oligo(dT) l8(50 g/mL)1 L,RNasin 1 L,加EDPC水至11 L,70 , 5 min；冰上驟冷30 s,加5×Rtbuffer 4 L,10

14、mmol/L dNTPMix 2 L,RNasin 1 L,加EDPC水至19 L,37 ,5 min；加M-Mulv反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/L)1 L,總體積20 L,42 ,60 min；70 , 10 min。    PCR反應(yīng)體系：cDNA產(chǎn)物2 L,Pre Mix Taq 12.5 L, 10 mol/L目的引物1 L,-actin引物1 L,加DEPC水至25 L,4 000 r/min短暫離心,于PCR儀擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)：94 預(yù)變性5 min,94 變性40 s,56.2 退火40 s,72 延伸45 s,32個(gè)循環(huán),最后72 延伸7 min。

15、0;   產(chǎn)物分析：取5 L反應(yīng)產(chǎn)物,2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,Eagle Eye圖像處理系統(tǒng)拍照。    用Bandleader Ver3.0軟件將PKC-擴(kuò)增產(chǎn)物的光密度值與-actin擴(kuò)增產(chǎn)物光密度值的比值作為表達(dá)水平的參數(shù),進(jìn)行半定量分析。3  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法    計(jì)量資料以x±s表示,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用方差分析,如方差齊用LSD法,方差不齊則用Dunnett T3法。4  結(jié)果4.1  一般情況    實(shí)驗(yàn)

16、過程中,模型組大鼠死亡4只,加味補(bǔ)肝湯組死亡3只,均在補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)齊到20只。    連續(xù)給藥后,模型組在鏈脲佐菌素注射72 h后逐漸出現(xiàn)多尿、多飲、多食、毛豎無光澤、蜷臥拱背等癥狀；加味補(bǔ)肝湯組也有類似表現(xiàn),但程度較模型組輕。4.2  各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的測(cè)定(見表2)  表2  各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較(略)注：與同期正常組比較,*P0.05；與同期模型組比較,#P0.05；與同組前一個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較,P0.05(下同)4.3  各組大鼠坐骨神經(jīng)中蛋白激酶C亞型mRNA的表達(dá)    各

17、組RT-PCR電泳結(jié)果顯示：模型組治療4、8周時(shí),PKC- mRNA表達(dá)(PKC-mRNA/-actin mRNA相對(duì)吸光度值比)顯著增加,隨病程延長PKC- mRNA含量進(jìn)一步增加,加味補(bǔ)肝湯干預(yù)后PKC- mRNA表達(dá)水平均明顯低于同期模型組(P0.05),但明顯高于正常組(P0.05)。提示加味補(bǔ)肝湯對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)PKC- mRNA表達(dá)有下調(diào)作用。見表3及圖1、圖2。  表3  各組大鼠坐骨神經(jīng)中PKC- mRNA含量半定量的比較(略) 5  討論     PKC-是經(jīng)典PKC家族亞型之一,激活時(shí)需要依

18、賴Ca2+、二?；视?DG)和磷脂酰絲氨酸(PS)或佛波酯(PMA),已有研究顯示,高血糖可激活腎臟PKC、,且優(yōu)先激活PKC-。另有研究報(bào)道,實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠模型心臟和主動(dòng)脈PKC-特異性升高5。用免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn),在糖尿病大鼠主動(dòng)脈及心臟組織中及與高糖培養(yǎng)的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中PKC-、亞型優(yōu)先被激活6。PKC-亞型參與了糖尿病視網(wǎng)膜、主動(dòng)脈、心臟、腎臟病變的發(fā)生發(fā)展,在糖尿病微血管并發(fā)癥中已顯示了極其重要的地位。同樣,PKC信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)糖尿病微血管病變之一的糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)生具有重要意義。PKC豐富存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的傳入、傳出神經(jīng),參與許多生理活動(dòng)如神經(jīng)遞質(zhì)釋放、

19、細(xì)胞增殖分化等,它是許多外在刺激因子如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生長因子等發(fā)揮作用的重要信號(hào)調(diào)節(jié)因子7-8。本實(shí)驗(yàn)觀察到,正常Wistar大鼠的坐骨神經(jīng)中PKC- mRNA僅少量表達(dá),而模型對(duì)照4、8周時(shí),PKC- mRNA表達(dá)出現(xiàn)顯著增加,隨病程延長PKC- mRNA含量進(jìn)一步增加。PKC-表達(dá)上調(diào)可影響一系列血管功能,包括血管舒縮反應(yīng)、血管通透性、內(nèi)皮細(xì)胞生長增殖、新生血管形成以及血液流變學(xué)等,并影響細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(ECM)變化,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-)基因表達(dá)等,這些生物效應(yīng)均參與了糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)病過程。而加味補(bǔ)肝湯干預(yù)后, PKC- mRNA表達(dá)水平均明顯低于模型組(P0.05),提示加味補(bǔ)肝湯能抑制糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)