NOX在糖尿病腎病氧化應(yīng)激損傷過程中的作用

1、中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志（電子版）2012年第4卷第9期專題筆談 15NOX在糖尿病腎病氧化應(yīng)激損傷過程中的作用朱斌1,2，李平1，張浩軍1，趙婷婷1（1中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所藥物藥理室，北京100029；2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥理系，北京100021）氧化應(yīng)激是指機(jī)體活性氧（reactive oxygen species ，ROS ）產(chǎn)生過多或機(jī)體抗氧化能力降低，從而導(dǎo)致潛在病理損傷的過程，早在1956年人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到ROS 可以對(duì)老化細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用1。ROS 主要包括氧自由基和非自由基的含氧產(chǎn)物，如超氧陰離子（O 2-）、羥自由基（OH）和過氧化氫（H 2O 2）等。生理狀態(tài)下機(jī)體R

2、OS 的產(chǎn)生與抗氧化系統(tǒng)保持動(dòng)態(tài)的平衡，適量的ROS 可以殺滅細(xì)菌及清除白細(xì)胞，在宿主的主動(dòng)防御中起到了積極的作用。當(dāng)高血糖、缺血再灌注，炎癥等情況下，ROS 的產(chǎn)生增多，或當(dāng)機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)受損，ROS 的產(chǎn)生和機(jī)體的抗氧化能力之間的平衡被打破時(shí)，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，造成組織與多器官的損傷。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase ，NADPH oxidase ，NOX ）是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)主要產(chǎn)生ROS 的酶，也被稱為ROS 產(chǎn)生的“心臟”2。體內(nèi)多種因素如糖代謝紊亂、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endoth

3、elial nitric oxide s y n t h a s e ，e N O S ）解偶聯(lián)，糖基化終末產(chǎn)物（advancedglycation end products，AGEs ）、血管緊張素（angiotensin ，Ang ）等均可以引起NOX 的表達(dá)升高，從而造成細(xì)胞和組織的氧化應(yīng)激損傷。腎臟是對(duì)氧化損傷敏感的器官之一，ROS 在糖尿病腎病的發(fā)展過程中起到重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)過量的ROS 可以造成腎小球足細(xì)胞的永久性損傷，引起蛋白尿的產(chǎn)生；還會(huì)影響到腎臟的血流動(dòng)力學(xué)改變，引起腎小球毛細(xì)血管通透性的改變；同時(shí)還會(huì)刺激細(xì)胞外基質(zhì)的過度增殖，造成腎小球肥大3。因此本文擬對(duì)NOX 在糖尿

4、病腎病發(fā)病過程中的作用進(jìn)行探討。1NOX過表達(dá)引起體內(nèi)O2-水平升高NOX 是細(xì)胞內(nèi)一組具有氧化活性的蛋白，其主要生物學(xué)功能是產(chǎn)生ROS ，它參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、天然免疫和激素合成等許多生物學(xué)功能4,5。研究發(fā)現(xiàn)NOX 是由多種亞單位組成的具有6個(gè)螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域的酶復(fù)合體，在其第3和第5次跨膜結(jié)構(gòu)域分別存在兩個(gè)可以與亞鐵血紅素緊密結(jié)合的保守組氨酸，同時(shí)該部位也是氧原子的結(jié)合位點(diǎn)；而在細(xì)胞基質(zhì)中存在黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD ）和還原型輔酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH ）的結(jié)

5、合位點(diǎn)6。研究發(fā)現(xiàn)NOX 主要由存在于細(xì)胞膜的p22phox ，gp91phox 以及存在于胞漿中的4個(gè)亞基p47phox 、p67phox 、p40phox 和小GTPase （Rac1、Rac2）所構(gòu)成。當(dāng)細(xì)胞受到外來刺激時(shí)，細(xì)胞中的p47phox 、p67phox 、p40phox基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81173422），國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)（No.2011DFA31860）通訊作者：李平Email：lp867516專題筆談和Rac1亞基就會(huì)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，與p22phox 和gp91phox 結(jié)合從而導(dǎo)致了ROS 的產(chǎn)生7。目前發(fā)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)主要存在著兩類結(jié)構(gòu)相似但功能不同

6、的NOX ，其一存在于中性粒細(xì)胞中，與宿主非特異性防御關(guān)系密切。生理狀態(tài)下，該酶存在于靜息狀態(tài)的細(xì)胞中，一旦受到外界刺激，可以迅速激活，并導(dǎo)致肉芽腫的形成；另一類即是存在于非吞噬細(xì)胞中的NOX （non-phagocytic NADPH oxidases ），并且近年來隨著研究的深入，非吞噬細(xì)胞中的NOX 越來越引起人們的重視8。在生理狀態(tài)下，非吞噬細(xì)胞中的NOX 可以在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)不斷地產(chǎn)生少量的O 2-，可以作為體內(nèi)氧化還原反應(yīng)的第二信使，與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等關(guān)系密切。一旦刺激超過細(xì)胞閾值，NOX 就會(huì)催化O 2生成O 2-，在經(jīng)過多種途徑衍生成H 2O 2、OH -及其他超氧分子，造成

7、組織的過氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)gp91phox 是NOX 最主要的亞基之一，并且是NOX 活性亞基。gp91phox 氨基端的300個(gè)氨基酸殘基可形成6個(gè)跨膜的螺旋，而羧基端的胞漿部分則構(gòu)成FAD 和NADPH 的結(jié)合位點(diǎn)9。動(dòng)物體內(nèi)gp91phox 存在7種同源結(jié)構(gòu)，根據(jù)這7種不同的結(jié)構(gòu)可以將NOX 分別命名為：NOX1（MOX1）、NOX2（gp9lphox ）、NOX3、NOX4（Renox ）、NOX5、Duox1和Duox210。雖然都屬于NOX 家族，在ROS 的產(chǎn)生過程中發(fā)揮了重要的作用，但這7個(gè)同源異構(gòu)體也存在不同之處：NOX15是分子量為65 KD 的核心蛋白，而Duox1，Du

8、ox2的分子量則為175180 KD；同時(shí)NOX14缺乏細(xì)胞外功能區(qū)域，而NOX5則具有EF-hand 和Ca 離子結(jié)合位點(diǎn)。DUOX1，DUOX2具過氧化物酶的結(jié)合位點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)與gp91phox 相似11。除此之外這7種同源結(jié)構(gòu)在體內(nèi)的分布也具有組織特異性?，F(xiàn)已證實(shí)NOX1主要在平滑肌中高表達(dá)，NOX2則主要分布在內(nèi)皮細(xì)胞和吞噬細(xì)胞中。NOX1/NOX2則主要調(diào)節(jié)血液、炎癥和細(xì)胞生長(zhǎng)；NOX3在胚胎腎和人耳中高表達(dá)，與人體的平衡覺和聽覺關(guān)系密切；NOX4主要在人體腎皮質(zhì)表達(dá)，與細(xì)胞的分化聯(lián)系緊密。NOX5則主要分布在免疫淋巴組織與內(nèi)皮細(xì)胞12。而Duox1和Duox2則主中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志（電

9、子版）2012年第4卷第9期要與甲狀腺的合成關(guān)系密切13。在這7種NOX 中，NOX4由于廣泛分布在腎臟血管、系膜細(xì)胞、腎小管、足細(xì)胞中，因此被認(rèn)為與腎臟病的發(fā)展關(guān)系密切。在糖尿病腎病患者體內(nèi)NOX4被持續(xù)激活，產(chǎn)生大量H 2O 214。在糖尿病腎病的發(fā)病過程中，NOX 的過度表達(dá)是造成腎臟系膜細(xì)胞基質(zhì)聚集、腎臟纖維化、足細(xì)胞損傷的主要原因之一。Eid AA等15證實(shí)高糖促進(jìn)NOX1和NOX4的表達(dá)升高，引起足細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，從而導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生。Liu GC等16發(fā)現(xiàn)敲除p47（phox-/-）后，小鼠糖耐量明顯提高，并且腎臟氧化應(yīng)激損傷，系膜細(xì)胞增生及腎小球肥大等病理改變明顯減輕。Sa

10、toshi Kinugasa 等17證明體內(nèi)ROS 過量表達(dá)可以導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白降解從而會(huì)引起足細(xì)胞的損傷，增大裂隙膜，導(dǎo)致蛋白的漏出，而通過抑制NADPH 亞基p47phox 和p67phox ，則可以有效減少蛋白尿和延緩糖尿病腎病進(jìn)展。Hwang I等18研究證實(shí)血漿游離脂肪酸可以促進(jìn)體內(nèi)ROS 的表達(dá)，而過氧化氫酶和乙酰半胱氨酸則可以有效降低ROS 的表達(dá)，并對(duì)腎臟起到一定的保護(hù)作用。Persson P等19證實(shí)，抑制腎臟NOX 表達(dá)，可以有效提高腎小球?yàn)V過率，降低腎皮質(zhì)和髓質(zhì)的耗氧量，同時(shí)還可以促進(jìn)腎小管對(duì)Na +的排出，有效保護(hù)腎功能。2eNOS解偶聯(lián)促進(jìn)腎臟病的發(fā)展體內(nèi)所有的一氧化氮合

11、酶（n i t r i c o x i d e synthases ，NOS ）具有相同的結(jié)構(gòu)，均是由可以結(jié)合NADPH ，黃素單核苷酸（flavin mononucleotide，F(xiàn)MN ）和FAD 的C 端還原酶結(jié)構(gòu)域和作為加氧酶結(jié)構(gòu)域的N 端組成的。研究發(fā)現(xiàn)單體NOS 不存在生物活性，只有當(dāng)兩個(gè)NOS 單體形成二聚體時(shí)，NOS 才會(huì)被活化20。作為體內(nèi)NO 合成過程中重要的催化物質(zhì)，NOS 廣泛存在于各種類型的細(xì)胞中。目前已確定3種亞型，分別為神經(jīng)元型NOS （neuronal nitric oxide synthase，nNOS ），誘導(dǎo)型NOS （inducible nitric o

12、xide synthase，iNOS ）和內(nèi)皮型NOS （eNOS ），其編碼基因分別定位于12、17和7號(hào)染色體上21。三種NOS 亞型在人體的分布各不相同，eNOS 主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志（電子版）2012年第4卷第9期nNOS 則廣泛分布在致密斑中，iNOS 只少量分布在腎臟遠(yuǎn)曲小管中22。在生理狀況下，nNOS 和eNOS 產(chǎn)生少量的NO ，分別起神經(jīng)遞質(zhì)和擴(kuò)張血管的作用。病理狀態(tài)下，如高血糖與炎性因子的刺激下，可以導(dǎo)致eNOS 的解偶聯(lián)與iNOS 的大量產(chǎn)生，從而產(chǎn)生過量的NO，通過和由NOX 所產(chǎn)生的O 2-結(jié)合，從而形成具有高度活性和毒性的過氧亞硝酸鹽和氧亞硝

13、酸，這些過氧化物可以和蛋白結(jié)合形成硝基酪氨酸，從而對(duì)組織和細(xì)胞造成損害23。糖尿病腎病的發(fā)病過程中，eNOS 的解偶聯(lián)與糖尿病腎病的氧化應(yīng)激損傷關(guān)系密切24。Huifang Cheng 等25通過體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病發(fā)病過程中，eNOS 表達(dá)量減少會(huì)直接導(dǎo)致系膜細(xì)胞增生與基底膜增厚，而通過外源性給入eNOS 的前體物質(zhì)，可以有效緩解ROS 所致的腎損害。四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin ，BH4）對(duì)于eNOS 生物功能的發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。BH4可以提供電子給加氧酶的鐵氧復(fù)合物從而使eNOS 保持穩(wěn)定，在這一反應(yīng)中轉(zhuǎn)變?yōu)橘|(zhì)子化的BH4可以迅速被從黃素類一氧化氮合

14、酶轉(zhuǎn)移來的電子還原，當(dāng)BH4生成不足時(shí)，黃素類一氧化氮合酶電子傳遞鏈與L-精氨酸氧化脫偶聯(lián)，從而導(dǎo)致了NOS 生成O 2-，而不是生理狀態(tài)下的NO ，同時(shí)BH4也被氧化成BH2。近年來的研究發(fā)現(xiàn)BH2與BH4對(duì)eNOS 具有相同的親和性，糖尿病腎病患者BH2表達(dá)升高，這也是導(dǎo)致BH4與eNOS 解偶聯(lián)的原因之一26。Minoru Satohd等27發(fā)現(xiàn)BH4含量減少，可以引起腎小球內(nèi)eNOS 解偶聯(lián)與NOX 表達(dá)升高，從而造成腎小球的氧化應(yīng)激損傷。3AGEs刺激NOX的表達(dá)晚期AGEs 是非酶糖化反應(yīng)的終末期產(chǎn)物，生理狀態(tài)下人體內(nèi)存在少量的AGEs ，可以通過腎臟清除體外，高血糖則能明顯加速體

15、內(nèi)AGEs 的形成。腎臟的血管、腎小球基底膜、系膜等結(jié)構(gòu)含有大量膠原蛋白，易形成AGEs ，使得腎臟更易受到AGEs 的損害28。體內(nèi)AGE 過量可以促進(jìn)血管內(nèi)O 2-的表達(dá)，從而造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。腎臟組織內(nèi)的AGE 及其受體RAGE 過表達(dá)，可專題筆談 17以激活PKC ，從而能導(dǎo)致P47phox 的磷酸化，引起NOX 表達(dá)上調(diào)，最終導(dǎo)致過量ROS 的產(chǎn)生29。糖尿病患者，腎臟組織內(nèi)過量葡萄糖可以自身氧化，在代謝應(yīng)激和蛋白非酶促糖基化形成AGEs 的過程中即可釋放大量的ROS ，而AGEs 又可通過與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS ，加重糖尿病腎病的進(jìn)展30。

16、Christos Tikellis等31研究發(fā)現(xiàn)，AGE 及其受體可以誘導(dǎo)體內(nèi)NOX 的活化從而導(dǎo)致組織氧化應(yīng)激損傷。Xue Gao等32研究發(fā)現(xiàn)AGE/RAGE可以提高NOX 亞基NOX-2，p22phox 和p40phox 的表達(dá)，從而引起了血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。4Ang 促進(jìn)NOX表達(dá)腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS ）是由一系列多肽蛋白和酶組成，主要包括血管緊張素原、腎素、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE ）、血管緊張素、血管緊張素及其受體等33。RAAS 過度激活可以導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)和功能損傷。其中由球旁器所分泌的

17、腎素經(jīng)過ACE 剪切后形成的Ang 在高血糖所導(dǎo)致的血管氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮著重要的作用。Ang 也可以直接刺激NOX 多個(gè)亞基的激活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS 和H 2O 2的產(chǎn)生，并引起線粒體內(nèi)ROS 的積聚34。而采用血管緊張素受體拮抗劑（ARB ）或者血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI ）類藥物可以有效降低體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，并且抑制腎臟NOX 的表達(dá)35。早在1957年人們就提出抑制腎素的分泌可以緩解RAAS 系統(tǒng)的過度激活對(duì)腎臟的損害36。研究發(fā)現(xiàn)Ang 可以通過G 蛋白偶聯(lián)受體激活NOX1，從而引起內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂37。Puvi N. Seshiah 等38發(fā)現(xiàn)Ang 可以上調(diào)NOX 的表達(dá)

18、，從而造成血管內(nèi)皮細(xì)胞O 2-，H 2O 2含量增高，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。腎臟足細(xì)胞是Ang 的靶細(xì)胞，通過增加足細(xì)胞內(nèi)Ca +含量與促進(jìn)氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致足細(xì)胞的不可逆的損傷，從而造成了大量蛋白的漏出39。Kinoshita Y等40發(fā)現(xiàn)通過ARB 阻斷血管緊張素受體，可以減少腎小管NOX 的表達(dá)，有效緩解腎小管的氧化損傷。Gandhi S 等3618專題筆談發(fā)現(xiàn)采用阿利克侖和奧美沙坦聯(lián)合可以顯著抑制大鼠RAAS 的過度激活，降低大鼠NOX 的過度表達(dá)，對(duì)腎臟具有明顯的保護(hù)作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素還可以下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞二氫葉酸還原酶（DHFR ）的表達(dá)，引起B(yǎng)H4生成減少，直接導(dǎo)致

19、了eNOS 的解偶聯(lián)，加重腎臟損傷41。5結(jié)語高血糖引起的氧化應(yīng)激在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要的作用。在高糖環(huán)境下，機(jī)體一方面清除氧自由基的酶活性降低，另一方面體內(nèi)的氧化應(yīng)激作用增強(qiáng)，造成了體內(nèi)大量活性氧自由基的積聚，導(dǎo)致活性氧連鎖反應(yīng)，從而促進(jìn)糖尿病腎病及其他并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展42。NOX 作為體內(nèi)產(chǎn)生O 2-的主要來源，對(duì)于糖尿病腎病的干預(yù)治療起到關(guān)鍵作用。目前對(duì)于糖尿病腎病氧化應(yīng)激損傷尚無效果理想的干預(yù)措施，且由于線粒體蛋白糖基化，引起細(xì)胞對(duì)高血糖的記憶效應(yīng)，因此在糖尿病腎病的治療過程中，應(yīng)該更加強(qiáng)調(diào)在糖尿病初期進(jìn)行嚴(yán)格的血糖控制和有效的生活方式干預(yù)，抑制過氧化物的產(chǎn)生，減輕腎

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