非培養(yǎng)方法在土壤微生物生態(tài)學研究中的應(yīng)用

1、非培養(yǎng)方法在土壤微生物生態(tài)學研究中的應(yīng)用3張漢波1,333段昌群2,3屈良鵠3(1云南大學生物學系,昆明650091;2云南大學環(huán)境科學系,昆明650091;3中山大學基因工程教育部重點實驗室,廣州510275摘要由于有相當數(shù)量的土壤微生物是目前不可培養(yǎng)的,因此利用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)來研究土壤微生物,不僅費時費力,所得到的結(jié)果可能和真實的情況相差甚遠。近年來發(fā)展了三類不需培養(yǎng)的方法來研究土壤微生物的種類和數(shù)量,這些方法大體上分為生物化學、生理學和分子生物學三類。生物化學方法主要根據(jù)細胞膜磷脂酸(PL FA 的種類和數(shù)量來判定微生物的多樣性;BIOLO G 微量板分析系統(tǒng)是生理學方法的代表,它主要是根

2、據(jù)土樣細胞懸液對95種單一碳源的利用模式來說明群落結(jié)構(gòu)的變化;分子生物學方法是發(fā)展應(yīng)用最廣的方法,基本步驟是提取土壤的總DNA ,然后用通用引物或選擇性高的引物來擴增16SrRNA 基因。由于對擴增產(chǎn)物分析方法的不同,該方法又可分為PCR 2D GGE ,PCR 2RFL P 等。最近在PCR 2RFL P 基礎(chǔ)上發(fā)展起來的T 2RFL P 分析方法,將微生物的多樣性分析工作同RDP (ribosomal database project 數(shù)據(jù)庫結(jié)合,充分利用了Internet 的數(shù)據(jù)資源共享的優(yōu)勢,具有分辨率高,可實現(xiàn)自動化等優(yōu)點,是未來土壤微生物生態(tài)學研究的有力工具。關(guān)鍵詞微生物多樣性,磷

3、脂酸,BIOLO G 微量板分析,末端限制性酶切片段長度多態(tài)性中圖分類號X172文獻標識碼A 文章編號1000-4890(200305-0131-06Culture independent methods for studies on microbial ecolo gy of soils.ZHAN G Hanbo 1,3,DUAN Changqun 2,3,QU Lianghu 3(1Depart ment of Biology ,Y unnan U niversity ,Kunming 650091,China ;2Depart ment of Environmental Science

4、,Y unnan U niversity ,Kunming 650091,China ;3Gene Engineering Key L aboratory ,Minist ry of Education ,Zhongshan U niversity ,Guangz hou 510275,China .Chinese Journal of Ecology ,2003,22(5:131136.Since most species of microorganisms in soils are not cultivable in the laboratory ,the investigation of

5、 their communities is a time 2consuming and hard work by traditional culture procedure.Moreover ,some wrong conclusions may be drawn.In the past decades ,three kinds of culture 2independent methods have been developed so that great progress has been made in this field.The biochemical method is to de

6、terminate the microbial communities b y analysis of phospholipid fatty acids (PL FA of cell membrane.The metabolism 2based approach ,through observations of the utilization patterns of 95single 2carbon sources performed on the BIOLO G microplates ,can provide a lot of information about the microbial

7、 functional groups in the soils.The third method ,molecular techniques ,is most prevalently used to explore the microbial communities.Briefly ,the molecular approach was started with the extraction and purification of total DNA from sam ple soils ,followed by PCR 2amplification of 16SrRNA gene with

8、universal or s pecial primers.As the analysis procedure of PCR products is dif 2ferent ,a variety of approaches ,for example ,D GGE ,RFL P and T 2RFL P ,have been established since 1990s.Among them ,T 2RFL P was developed based on the RFL P in 1997.This method com 2bined ribosomal database project (

9、RDP into the analysis of microbial communities ,and the number and constituents of s pecies within a community were inferred just according to the number and inten 2sity of the terminal restriction fragments of 16S rRNA gene.Performing T 2RFL P is simple ,with high resolution ,and can be carried out

10、 automatically.Therefove it will play more and more impor 2tant role in future research in microbial ecology of soils.K ey w ords microbial diversity ,phospholipid fatty acid ,BIOLO G microplates assay ,terminal re 2striction fragment length polymorphism.3云南省工業(yè)微生物發(fā)酵工程重點實驗室開放基金項目(KF2001201;云南省自然科學基金項

11、目(2002C0001Q 、國家自然科學基金項目(39970142、云南省教育廳自然科學基金重點項目資助(02ZD013和中山大學教育部基因工程重點實驗室開放基金資助項目。33通訊作者收稿日期:2002-05-04改回日期:2002-11-151引言土壤微生物是土壤分解系統(tǒng)的基本組成部分,在生物地化循環(huán)中有極其重要的作用。據(jù)估計,土生態(tài)學雜志Chinese Journal of Ecology 2003,22(5:131136壤中原核生物的數(shù)量約為216×1026個細胞,含有的N、P與陸生植物相當。如此巨大的生物群體和它們快速的生長率產(chǎn)生了極大的遺傳多樣性,構(gòu)成了地球上生物遺傳多樣性

12、的大部分1,2。豐富多樣的微生物種類不僅是維持土壤健康的重要因素,多樣性的變化也是監(jiān)測土壤質(zhì)量變化的敏感指標,因此土壤微生物的種類和數(shù)量一直是微生物生態(tài)學研究的重要內(nèi)容。由于土壤微生物種群固有的特點,考察其種的豐富度和均一度是個極其艱巨的任務(wù),主要體現(xiàn)在以下三個方面。一是種類繁多。估計每1g土壤約有4×1034×104個種5,全球僅細菌數(shù)就可達10 50萬之多1;二是目前能培養(yǎng)的種類很少。傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)僅能分離1%10%的土壤微生物5;三是重培養(yǎng)過程本身是一個重新選擇的過程,得出的結(jié)果并不能反映原始的群落結(jié)構(gòu)17。近年來基于生物化學、生理學和分子生物學發(fā)展起來的三大類新方法

13、,力圖克服培養(yǎng)這個難點,對土壤微生物生態(tài)的研究產(chǎn)生了極大的促進作用。本文就這幾個方法的應(yīng)用原理以及它們的特點等進行評述。2生物化學方法的代表磷脂酸法PL FA存在于細胞膜中,由于不同的微生物具有不同的PL FA種類和數(shù)量,因此可以作為了解自然環(huán)境中微生物種類組成和數(shù)量變化的指標。但PL FA模式并不能給出一個實際的微生物種類組成,僅是群落結(jié)構(gòu)的概圖。在有的情況下,某種PL FA的濃度改變與某些特異的微生物類群的改變密切相關(guān)22。PL FA分析的原理和方法。取一定量的待分析土樣(015g左右的新鮮土壤或210g干土,加氯仿2甲醇2檸檬酸(12018緩沖液直接抽提樣品的總PL FA,提取的PL F

14、A經(jīng)硅膠柱分離為中性脂肪酸、糖脂肪酸和磷脂酸。磷脂酸溶于甲醇/甲苯(11,v/v溶液,然后加012molL-1KOH,37酯化15min后8,用氣相色譜分析磷脂酸甲酯。磷脂酸的種類用總碳原子數(shù):雙鍵數(shù)量表示,緊跟著后面的數(shù)字表示雙鍵離甲基末端的位置。前綴a和i分別表示有anteiso和iso分支;br表示未知的分支;cy 表示環(huán)丙烷(cyclopropane脂肪酸;Me表示甲基團離羧端的位置。分析結(jié)果可根據(jù)以下一些標準來判定:一般來說,i15:0,a15:0,15:0,i16:0,16:19, 16:7t,i17:0,a17:0,cy17:0,18:17和cy19:0是細菌特有的,它們的總合可

15、代表細菌生物量; 18:26是真菌代表;真菌PL FA/細菌PL FA可代表土壤中真菌和細菌數(shù)量比例;放線菌常在離羧端第10碳原子上有一個甲基團,因此10Me18:0被用來作為放線菌存在的標志9;脂肪酸的濃度可用甲基十九烷脂肪酸(190作為內(nèi)標來進行定量測定,總量用nmolcm-3表示9,22;G+細菌有更多的iso-,anteiso-,或者其他分支脂肪酸,G-細菌有較多的單一未飽和脂肪酸或環(huán)脂肪酸9。該法檢測靈敏度高,單個脂肪酸的最低檢測水平是4pmolg-1土壤16。PL FA的分析結(jié)果有時要結(jié)合生態(tài)因子進行綜合評價,才能獲得準確的信息。Pennanen等22測定受重金屬污染的針葉林土壤的

16、微生物多樣性發(fā)現(xiàn),樣品中1826脂肪酸隨污染程度的加重,數(shù)量急劇降低,表明該地區(qū)真菌數(shù)量隨污染的加重急劇減少。由于真菌相對細菌來說對重金屬的污染不敏感,這種相反的結(jié)果要結(jié)合樣地的情況來解釋。因土壤中該脂肪酸主要來自外生菌根菌,在污染嚴重的樣地,植物急劇減少,該脂肪酸的比例下降是可以理解的。另外,1615是內(nèi)生菌根真菌的代表脂肪酸,但它在細菌中也有發(fā)現(xiàn)。因為研究樣地植物稀少,該脂肪酸代表的應(yīng)是細菌而不是菌根真菌的情況。3生理學的方法BIOLOG微量分析B IOLO G微量板分析系統(tǒng)是由Biolog公司發(fā)展,用來測定微生物對95種碳源的利用情況并據(jù)此來對化能異養(yǎng)細菌進行鑒定的系統(tǒng)。G arland

17、等10首先報道了這種碳源利用信息可把一些不同種類的土壤和水體的微生物區(qū)系區(qū)別開。Zak等28把這種系統(tǒng)作為一種定量方法用來評價與6種植物區(qū)系相關(guān)的微生物群體的功能多樣性。Haack等12進一步的研究表明了模式細菌群落的利用情況重現(xiàn)性很好。近年來,該方法在分析不同土壤特別是重金屬污染土壤中的微生物多樣性方面顯示了越來越重要的作用6,1315,19。另外,在實驗室長期培養(yǎng)傳代的微生物群體遺傳結(jié)構(gòu)的差異研究方面也有初步的嘗試7,23。B IOLO G依據(jù)的原理很簡單,在分析板上有96個孔,一個孔沒有含任何碳源作對照,其余95個孔每孔含有一種碳源和氧化還原染料四氮唑藍。底物利用產(chǎn)生的氧化還原電勢的變化

18、可導致染料的顏色231生態(tài)學雜志第22卷第5期發(fā)生變化,變化的速率和程度代表了底物被利用的速率和程度。微生物群落結(jié)構(gòu)不同,95個孔的顏色變化方式就不同,這樣可以知道不同樣點微生物區(qū)系的差異。其方法是取一定的土壤(10g干重土壤,溶于90ml無菌緩沖溶液中并搖勻。靜止一段時間后,取上清液稀釋,用不同的稀釋液接種,25培養(yǎng)觀察。每隔一定時間通過B IOLO G微量板閱讀器閱讀一次,建立一個顏色變化同時間的線性關(guān)系并據(jù)此確定適合的接種量和培養(yǎng)時間6,15。然后利用B IOLO G分析不同樣點的B IOLO G值進行聚類分析比較,最后通過SAS統(tǒng)計軟件進行主成分分析(PCA。詳細的B IOLO G數(shù)據(jù)

19、分析見相關(guān)參考文獻13,14。Knight等15利用B IOLO G分析不同p H和重金屬處理的沙壤土的微生物多樣性變化時發(fā)現(xiàn),代謝活性低的樣品,碳源的利用模式重現(xiàn)性較差,活性高的樣品重現(xiàn)性好;就某個碳源來說,利用強度變化較大。Bossio等6認為,對于粘土,用1000倍稀釋液接種較合適。稀釋度太低,較多的粘土會干擾閱讀,稀釋度太高,接種量小而導致重復實驗結(jié)果不穩(wěn)定。為了避免丟失細胞,接種時無需離心去除土壤顆粒。4分子生物學方法基于DNA和RNA信息,特別是16SrRNA基因來研究微生物多樣性的分子生物學方法,在土壤微生物的研究中顯示了極大的應(yīng)用前景11。這類方法的共同點都是首先從土壤中提取總

20、DNA,選擇合適的引物進行PCR擴增。對擴增產(chǎn)物的分析方法不同可以分為PCR2D GGE,PCR2RFL P(又稱為ARDRA等,關(guān)于它們的應(yīng)用例子和詳細的說明可參考相關(guān)文章和評述24,21,25,27,本文主要對基于RFL P建立起來的一種新的方法末端限制性酶切長度片段多態(tài)性(terminal restriction fragment length polymorphism,T2RFL P研究方法進行詳細的介紹。T2RFL P法的步驟是:提取總DNA,保守區(qū)序列為引物擴增16SrRNA基因。引物的5端(或3端有熒光標記,以便給擴增產(chǎn)物加上標簽。擴增產(chǎn)物通常用42堿基識別位點的內(nèi)切酶消化,用自

21、動化DNA測序儀分析帶熒光標記的5末端限制性片段的大小和濃度。根據(jù)特異片段的數(shù)量可以表明微生物區(qū)系的多樣性,還可根據(jù)已知序列鑒定到種,熒光強度的大小可以確定種的豐富度17,18。Liu等17首先探索了方法的可行性。他們先從RDP數(shù)據(jù)庫中選擇1007個真細菌序列和95個古菌序列。再選擇4對引物,用匹配軟件計算引物同上述序列的配對特異性并預測了10個4-bp識別位點的限制性酶如A l u I(A GCT、Bst U I(CGCG等消化后的T2RFs(末端限制性酶切片段的理論長度。配對特異性通過總序列中可以配對的百分比表示,T2RFs長度出現(xiàn)的頻率用SAS進行統(tǒng)計分析。研究表明,引物對8f2926r

22、可以和上述1102個序列中的686個配對,用Hha I消化后,可以產(chǎn)生194個長度特異性的5末端片段,如果用Hha I同Msp I組合消化,特異性片段的數(shù)量可提高到233個(圖1。根據(jù)模擬的結(jié)果,用兩種熒光標記8f2926r引物對,擴增了人工模式群體(包含6個已知菌株:A l2 caligenes f aecalis ALC1,Ralstonia eut ropha, A rthrobacter globif orm is A TCC8010,B acill us sub2 tilis BAC11,Escherichia coli HB101,Pseudomonas aerugi nosa A

23、 TCC27853的16SrRNA基因,產(chǎn)物用Hha I消化,經(jīng)自動測序儀分離消化產(chǎn)物。由于兩個引物用的是不同顏色的熒光標記,因此分離后每個菌株產(chǎn)生了兩個末端片段(5和3端。熒光標記可以確保分析儀僅測定了末端的片段。結(jié)果可以清楚地看到,不管是用5還是3末端片段的大小和數(shù)量,都可以準確地判定混合群體中有6個不同的群體(圖2。接下來,他們用這樣的方法評價了活性污泥等4個天然微生物群體的多樣性。研究表明,用T2RFs長度片段多態(tài)性來分析微生物群落多樣性的可行性。使用T2RFL P分析依賴于采用合適的引物對和消化酶,以便得到最大數(shù)量的特異性末端片段。這樣,分析前必須要了解所有16SrDNA上的限制性酶

24、切位點、片段大小和種系的關(guān)系。Marsh等18發(fā)展了一個網(wǎng)站(www1cme1msu1edu/RDP/trflp/#pro2 gram,將種系統(tǒng)發(fā)育樹、模式查詢運算法則(a pat2 tern2searching algorithm同RDP(ribosomal database project進行整合,提供研究者快速的決定合適引物和限制性酶的組合。另外,也可隨時通過數(shù)據(jù)庫中的同源種(cognate phylotypes來進一步鑒定通過實驗定的種。該網(wǎng)站還可回答下列有關(guān)使用T2RFL P 的問題:估計群體多樣性采用什么樣的限制酶最合適;什么酶可以最好的分辨所感興趣的種群;331張漢波等:非培養(yǎng)方

25、法在土壤微生物生態(tài)學研究中的應(yīng)用圖1 計算機模擬得到的末端長度片段多態(tài)性Fig.1H istograms of the predicated 5T 2RFS lengths by computer simulation圖2模式群落的電泳Fig.2E lectropherograms of model community最適合你所調(diào)查的區(qū)系的引物2酶組合。該網(wǎng)站已變更至:www 1cme 1msu 1edu/RDP/html/index 1html ,詳細的內(nèi)容可到網(wǎng)上查詢。5結(jié)語在微生物生態(tài)學的研究工作中應(yīng)用非培養(yǎng)的技術(shù),無疑克服了培養(yǎng)過程產(chǎn)生的很多困難,提高了研究結(jié)果的真實性。但研究天然土壤

26、的微生物種類和數(shù)量的變化本身是一個極其艱巨的任務(wù),面臨的可變因素極為復雜,因此沒有一個方法是十全十美的。對于PL FA 來說,特殊儀器設(shè)備的要求和復雜的實驗方法限制了它的應(yīng)用。另外,PL FA 的一個峰可431生態(tài)學雜志第22卷第5期能含有不同種的細菌的脂肪酸27。因此,在大多數(shù)情況下只能通過PL FA數(shù)量和種類來初步判定不同土樣間群落結(jié)構(gòu)的差異,更細節(jié)的信息該方法將無能為力。但該方法對細胞生理活性沒有特殊的要求。對樣品保存的時間也要求不高。B IOLO G分析主要依賴群體的生理活性,特別是脫氫酶活性,因此,該法不能檢測到休眠群體,也不能檢測到那些不能利用B IOLO G底物的群體。此外,如果

27、不能很好地解釋一個區(qū)系中微生物種類的相互作用如何影響底物的利用情況,很難把這些變化同種類變化聯(lián)系起來。另外,該方法需要微生物在同野外環(huán)境完全不同的溶液(B IOLO G微量板中是代謝活躍的,因此也不能期望它的結(jié)果反映了整個土壤區(qū)系的代謝情況6。但B IOLO G應(yīng)用起來非常方便,適合大規(guī)模的野外分析。由于T2RFL P是建立在PCR2RFL P的基礎(chǔ)之上,影響這些方法的因素同樣限制了T2RFL P的應(yīng)用,如DNA提取的代表性和完全性問題20以及PCR的擴增偏差等24。此外,解釋T2RFL P的結(jié)果應(yīng)當謹慎。比如物種豐富度的解釋,在數(shù)量上不占優(yōu)勢的種的DNA模板在總DNA中占一小部分,很難檢測到

28、這些種類使得種的多樣性水平降低。另外,不同種的基因數(shù)量有差異,同一菌種的rRNA基因的序列差異在05%。因此即便是同一個種,產(chǎn)生的T2RFs差異也可能存在17。實際上,所有的分子生物學方法都受這些因素的影響。但比較起來,T2RFL P法分辨率相對要高,可以實現(xiàn)自動化,多態(tài)性分析只限于末端長度片段等,使得該方法具有較大應(yīng)用優(yōu)勢。更重要的是,T2RFL P法可以和RDP數(shù)據(jù)庫連接,充分利用了Internet數(shù)據(jù)資源共享的優(yōu)勢?？梢灶A期,該方法將會在微生物生態(tài)學的研究中產(chǎn)生極大的推動作用。當然,在應(yīng)用時應(yīng)根據(jù)采集的土壤樣品、保存時間、分析的目標要求等來決定采用何種方法。并通過適當?shù)慕M合,將以上這些方

29、法有機結(jié)合起來,從不同的角度來解釋所獲得的數(shù)據(jù),將會更加真實地反映自然土壤中微生物群體的區(qū)系結(jié)構(gòu)。參考文獻1東秀珠,洪俊華.2001.原核微生物的多樣性J.生物多樣性,9(1:1824.2陳曉蕾,張忠澤.1999.微生物的ARDRA檢測J.微生物學雜志,9(4:4043.3楊永華,姚健.2000.分子生物學方法在微生物多樣性研究中的應(yīng)用J.生物多樣性,8(3:337342.4崔雨新,王小明.1999.分子生物學技術(shù)在環(huán)境生物學中的應(yīng)用J.自然雜志,21(5:295301.5Borneman J,et al.1996.Molecular microbial diversity of an agr

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