兩株腫瘤細(xì)胞系HLAI類(lèi)分子基因表達(dá)水平的鑒定及意義

1、兩株腫瘤細(xì)胞系HLA?I類(lèi)分子基因表達(dá)水平的鑒定及意義       作者：關(guān)德瑩，沈晗，邵紅偉，黃樹(shù)林  【摘要】  目的 探討兩株常見(jiàn)腫瘤細(xì)胞系Hela細(xì)胞和BEL?7402細(xì)胞HLA?I類(lèi)分子基因表達(dá)水平及其影響CTL反應(yīng)性的可能意義。方法 提取腫瘤細(xì)胞的基因組DNA，利用PCR反應(yīng)在基因組水平鑒定HLA?I類(lèi)分子基因的拷貝數(shù)情況；提取細(xì)胞總RNA， RT?PCR反應(yīng)合成cDNA，利用PCR反應(yīng)鑒定腫瘤細(xì)胞HLA?I類(lèi)分子在RNA水平的表達(dá)情況。結(jié)果兩株腫瘤細(xì)胞的HLA?I類(lèi)基因在基因組水平的拷貝數(shù)無(wú)明顯下降；

2、在RNA水平上，Hela細(xì)胞的HLA?A、HLA?B和HLA?C基因均有表達(dá)，表達(dá)水平無(wú)明顯下降，BEL?7402細(xì)胞的HLA?A和HLA?C基因有表達(dá)，但HLA?C基因表達(dá)水平降低，而HLA?B基因未見(jiàn)明顯表達(dá)。 結(jié)論 RNA水平上，部分HLA?I類(lèi)分子基因表達(dá)的降低或缺失推測(cè)可能是導(dǎo)致BEL?7402細(xì)胞比Hela細(xì)胞出現(xiàn)CTL反應(yīng)性下降的原因之一。 【關(guān)鍵詞】  HLA?I類(lèi)分子；Hela細(xì)胞；BEL?7402細(xì)胞；mRNA Abstract:Objective To investigate the expression level of HLA?I molecule gene

3、s in two tumor cell lines, Hela and BEL?7402 and the possible significance of CTL reactions.Methods Genome DNA were extracted from these two tumor lines for detecting the HLA?I molecule genes levels by PCR.Total RNA from two cell lines were extracted for RT?PCR, HLA?I molecule genesexpression on RNA

4、 level were judged by PCR and agarose gel electrophoresis.Results  HLA?I molecule genes levels did not decrease significantly on genome level.On RNA level, HLA?A, HLA?B and HLA?C all expressed normally without significant descent in Hela cell line.The expression of HLA?A and HLA?C were both det

5、ected in BEL?7402 cell line, but the expression of HLA?C gene showed significant decease, and no expression of HLA?B gene were detected on RNA level.Conclusion  At RNA level, reduction or absence HLA?I molecule genes expression of Hela cell line were not found, however, the partial descent and

6、absence of HLA?I molecule genes expression in BEL?7402 cell line was the possible reason for the reduction of CTL reaction. Key words:HLA?I molecule；Hela cell line ；BEL?7402 cell line；mRNA 人類(lèi)主要組織相容性復(fù)合物（MHC），又稱(chēng)為人類(lèi)白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA )系統(tǒng)，位于第6號(hào)染色體短臂（6p21.31）約3.6Mb1，按功能差別可大致分為HLA?I類(lèi)分子和HLA?

7、II類(lèi)分子兩大類(lèi)，其中HLA?I 類(lèi)分子在機(jī)體的細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤免疫的核心是機(jī)體針對(duì)腫瘤的細(xì)胞免疫反應(yīng)，其中CD8+CTL細(xì)胞必需依靠腫瘤自身HLA?I類(lèi)分子呈遞的腫瘤抗原才能得以活化發(fā)揮殺傷作用。但由于腫瘤細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定性，會(huì)導(dǎo)致HLA?I類(lèi)分子的表達(dá)下降或缺失，是引起腫瘤免疫耐受形成的重要原因2, 3。因此，了解腫瘤細(xì)胞的HLA?I類(lèi)分子表達(dá)情況對(duì)研究如何打破免疫耐受，開(kāi)展過(guò)繼性細(xì)胞學(xué)治療十分必要。在前期通過(guò)CTL殺傷實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)，CTL對(duì)本室保藏的人宮頸癌細(xì)胞Hela的殺傷活性要高于人肝癌細(xì)胞株BEL?7402(結(jié)果未發(fā)表)，為探討此現(xiàn)象的發(fā)生是不是涉及到了

8、腫瘤細(xì)胞HLA?I類(lèi)分子基因的表達(dá)變化，本文在基因組水平及RNA水平對(duì)兩株腫瘤細(xì)胞的HLA?I類(lèi)分子基因的表達(dá)情況進(jìn)行了鑒定分析，現(xiàn)報(bào)道如下。    1  材料與方法 11  細(xì)胞     Hela細(xì)胞、BEL?7402細(xì)胞均為廣東藥學(xué)院生物制藥研究所保藏，健康人外周血由廣州市血液中心提供，用人淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞。 12  主要試劑與儀器    RPM1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)置Gibico公司；T4連接酶、M?MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、dNTP、RNa

9、seInhibitor、Oligod T均購(gòu)自Fermentas公司；Trizol 0020購(gòu)自Invitrogen公司；DEPC購(gòu)自Sigma公司；DNA Marker DL 2000、100購(gòu)自Biotech公司，基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Pearl公司；PCR儀（Whatman Biometra，T?Gradient Thermoblock型）；電泳儀（Bio?RAD，Power Pac 300型）；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon 4100型）。 13  細(xì)胞基因組DNA的提取         收集傳代培

10、養(yǎng)24 h的Hela細(xì)胞和BEL?7402細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)約為2×106，按照基因組DNA提取試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行操作，將提取獲得的DNA進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。按相同方法，提取健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的基因組DNA作為對(duì)照。 14  PCR反應(yīng)鑒定基因組水平HLA?I基因的拷貝數(shù)情況     根據(jù)GenBank中已公布的人HLA?I類(lèi)基因HLA?A、HLA?B和HLA?C核酸序列，共設(shè)計(jì)3對(duì)通用PCR反應(yīng)引物，并設(shè)計(jì)1對(duì)針對(duì)GAPDH基因組序列的內(nèi)參引物，委托廣州英駿公司合成，4對(duì)引物序列具體為：  

11、;  PGA1:5?cctctgyggggagaagcaa?3，PGA2:5?gac tcagaagtgctggactc?3；    PGB1:5?gggaggagcgaggggaccscag?3，PGB2:5?ggaggccatccccggcgacctat?3；    PGC1:5?agcgaggkgcccgcccggcga?3，PGC2:5?ggagatggggaaggctccccact?3；    PGG1:5?aaggtcggagtcaacgg?3，PGG2:5?atc tcgggcgg

12、gaatag?3    用50 L反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，其參數(shù)為：95 預(yù)變性3 min后，按95 25 s、60 30 s、72 80 s進(jìn)行8個(gè)循環(huán)反應(yīng)，然后按照95 20 s、55 30 s、72 90 s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，最后延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。 15  RT?PCR反應(yīng)鑒定RNA水平HLA?I基因的表達(dá)情況     分別收集3×106Hela細(xì)胞、 BEL?7402細(xì)胞及健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞，按 Trizol Reagent使用說(shuō)明進(jìn)行抽提細(xì)胞總RNA，

13、以RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系中加入10 mmol/L的dNTPs 2 L、RNaseInhibitor 20 U、OligodT 0.3 g、RNA模板6 L、5×Buffer 8 L、M?MLV逆轉(zhuǎn)錄酶200 U，加無(wú)菌去離子水至終體積40 L?；靹蚝?2 反應(yīng)60 min，最后90 5 min滅活M?MLV活性，4 保存合成的cDNA。    擴(kuò)增HLA?A、B、C 3個(gè)基因及內(nèi)參GAPDH基因的引物均由Invitrogen公司合成。具體序列如下：    PRA1:5?gacgacacgcagt

14、tcgtgc?3,PRA2：5?ttg gaccgcggcggacatg?3；    PRB1：5?accagagcgaggccgggt?3，PRB2：5?ctg gaccgccgcggacac?3；    PRC1：5?cgccgcgagtccgagagg?3，PRC2：5?ctg gaccgccgcggacac?3；    PRG1：5?aggtcggagtcaacggatttg?3，PRG2:5?gtg atggcatggactgtggt?3    用50 L反應(yīng)體系進(jìn)

15、行擴(kuò)增，其參數(shù)為：94 預(yù)變性3 min，按94 60 s，55 40 s，72 60 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)反應(yīng)。 2  結(jié)果 21  基因組DNA的提取鑒定     0.8%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示試劑盒法提取的Hela細(xì)胞、BEL?7402細(xì)胞及健康人PBMC基因組DNA條帶明亮，無(wú)明顯托尾，能滿足作為PCR反應(yīng)擴(kuò)增模板的需要，見(jiàn)圖1。    M.DNA marker; A.PBMC of healthy people; B.Hela cell; C.BEL?7402 cell 圖1  基因組D

16、NA凝膠電泳（略） Fig.1  Gel electrophoresis analysis of genome DNA 22  HLA?I類(lèi)基因在基因組水平拷貝數(shù)情況的鑒定     利用特異性PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)基因組水平HLA?I類(lèi)基因的拷貝數(shù)情況，結(jié)果見(jiàn)圖2，Hela細(xì)胞和BEL?7402細(xì)胞的HLA?I類(lèi)基因（HLA?A、B、C）在基因組水平的表達(dá)與健康人PBMC無(wú)明顯差別。 23  細(xì)胞總RNA提取鑒定    從Hela細(xì)胞和BEL?7402細(xì)胞中，提取出總RNA， 1%瓊脂糖電

17、泳鑒定 。結(jié)果顯示提取的總RNA有3條帶，從上至下分別為28 s，18 s，5 s，其中18 s和28 s這2條帶的RNA亮度明顯高于5 s帶，證明RNA降解較少，所提取RNA質(zhì)量較高，能滿足下一步RT?PCR反應(yīng)的需要，見(jiàn)圖3。    M.DNA marker; 1.HLA?A gene of healthy people; 2.HLA?A gene of Hela; 3.HLA?A gene of BEL?7402; 4.HLA?B gene of healthy people; 5.HLA?B gene of Hela; 6.HLA?B gene of BE

18、L?7402; 7.HLA?C gene of healthy people; 8.HLA?C gene of Hela; 9.HLA?C gene of BEL?7402; 10.GAPDH gene of healthy people; 11.GAPDH gene of Hela; 12.GAPDH gene of BEL?7402. 圖2  基因組水平HLA?I基因PCR結(jié)果（略） Fig.2  PCR Results of HLA?I gene at genome level A.Hela cell     B.BEL?740

19、2 cell  圖3  腫瘤細(xì)胞RNA凝膠電泳圖（略） Fig.3  Gel  electrophoresis of the RNA of tumor cells 24   HLA?I類(lèi)基因在RNA水平上的表達(dá)情況 241  Hela細(xì)胞HLA?I類(lèi)基因的表達(dá)  以Hela細(xì)胞cDNA為模板，進(jìn)行HLA?I類(lèi)基因的PCR擴(kuò)增，2%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示Hela細(xì)胞HLA?A、HLA?B和HLA?C 3基因都擴(kuò)增出比較明亮的DNA條帶，對(duì)照組健康人PBMC無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖4中2,5,8,11泳道。 242 

20、; BEL?7402細(xì)胞HLA?I類(lèi)基因的表達(dá)  利用2%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)BEL?7402細(xì)胞HLA?I類(lèi)基因擴(kuò)增情況進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示HLA?A基因的擴(kuò)增條帶較明亮與對(duì)照組無(wú)明顯差別，HLA?C基因的擴(kuò)增條帶亮度較對(duì)照組有明顯的降低，而HLA?B基因未見(jiàn)DNA條帶擴(kuò)增出來(lái)，見(jiàn)圖4中3，6，9，12泳道。 3  討論     人類(lèi)主要組織相容性復(fù)合物（MHC），又稱(chēng)為人類(lèi)白細(xì)胞抗原 (human leukocyte antigen，HLA )系統(tǒng)是一個(gè)很大的基因家族，在脊椎動(dòng)物適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。在機(jī)體的腫瘤免疫應(yīng)答過(guò)程中，

21、HLA?I類(lèi)分子限制的CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 (CTL)發(fā)揮著重要作用，腫瘤免疫應(yīng)答刺激信號(hào)的產(chǎn)生主要涉及到MHC?抗原肽?TCR三原體結(jié)構(gòu)的生成4。    M.DNA marker; 1.HLA?A gene of healthy people; 2.HLA?A gene of Hela; 3.HLA?A gene of BEL?7402; 4.HLA?B gene of healthy people; 5.HLA?B gene of Hela; 6.HLA?B gene of BEL?7402; 7.HLA?C gene of healthy people

22、; 8.HLA?C gene of Hela; 9.HLA?C gene of BEL?7402; 10.GAPDH gene of healthy people; 11.GAPDH gene of Hela; 12.GAPDH gene of BEL?7402. 圖4  RNA水平HLA?I基因PCR結(jié)果（略） Fig.4  PCR Results of HLA?I gene at RNA levelHLA?I類(lèi)分子的表達(dá)異常是發(fā)生腫瘤免疫逃逸，形成免疫耐受的重要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，在很多腫瘤細(xì)胞中都存在著HLA基因丟失或表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象。有研究利用免疫組化檢測(cè)證實(shí)，2575的惡性腫瘤細(xì)胞有不同形式的HLAI類(lèi)分子表型改變，從 HLA?I類(lèi)分子陽(yáng)性上皮細(xì)胞衍生的腫瘤細(xì)胞中，3988存在 HLAI類(lèi)分子的表達(dá)下降或丟失，而正常細(xì)胞均表現(xiàn)為 HLA?I類(lèi)分子陽(yáng)性。以上數(shù)據(jù)證明腫瘤細(xì)胞的HLA?I類(lèi)分子的表達(dá)降低或缺失是惡性腫瘤的一個(gè)較為普遍的病理性改變，是腫瘤區(qū)別正常組織的一項(xiàng)重要指標(biāo)5。     在前期