兩型星形膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)譜差異的初步觀察

1、兩型星形膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)譜差異的初步觀察 作者：嚴(yán)美娟 萬明輝 李春鵬 夏春林【摘要】 目的：研究不同型別星形膠質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)譜，比較1型和2型星形膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)譜之間的差異，以進一步研究兩者的生物學(xué)特性及其功能。方法：原代培養(yǎng)新生SD大鼠大腦皮質(zhì)混合膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)振蕩和差速消化純化培養(yǎng)1型星形膠質(zhì)細(xì)胞（T1A）和2型星形膠質(zhì)細(xì)胞（T2A）；應(yīng)用基因芯片技術(shù)獲取T1A和T2A的基因表達(dá)譜，并對兩者的基因表達(dá)譜進行初步分析。結(jié)果：基因芯片上檢測點4096個，共有差異表達(dá)基因267條，其中113條在T1A中高表達(dá)，154條在T2A中高表達(dá)。結(jié)論：本實驗獲得大鼠大腦T1A和T2A的基因表達(dá)譜，首次

2、報道267條存在于T1A和T2A之間的差異表達(dá)基因。 【關(guān)鍵詞】 星形膠質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞譜系；基因表達(dá)譜；基因芯片隨著研究的不斷深入，人們已認(rèn)識到膠質(zhì)細(xì)胞不僅對神經(jīng)元有支持、分隔絕緣、形成髓鞘、營養(yǎng)、修復(fù)和再生等多種功能。并積極參與神經(jīng)元的活動，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的代謝和離子環(huán)境，對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和正常生理活動以及病理變化都具有重要作用。而且膠質(zhì)細(xì)胞對正常腦發(fā)育、神經(jīng)元的調(diào)控和中樞再生等方面所發(fā)揮的作用，已不亞于神經(jīng)元本身。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的膠質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)發(fā)生分化譜系的不同可分為1型(type 1 astrocyte, T1A)和2型(type 2 astrocyte, T2A)星形膠質(zhì)

3、細(xì)胞，兩者行使著某些不同的生物學(xué)功能13。目前有關(guān)T1A和T2A基因表達(dá)差異的研究尚未見文獻(xiàn)報道。本實驗應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究T1A和T2A基因表達(dá)譜及其之間的差異，這對認(rèn)識不同型別星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能有極其重要的意義。1 材料與方法1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取新生SD大鼠大腦皮質(zhì)作原代混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，采用振蕩法和胰酶差速消化法，結(jié)合使用富含血清培養(yǎng)基，分別純化培養(yǎng)T1A和T2A4。將大鼠大腦T1A作為對照組，T2A作為實驗組。1.2 基因芯片 采用上海博星基因芯片責(zé)任有限公司芯片，芯片類型為BiostarR-40S。1型星形膠質(zhì)細(xì)胞（對照組）樣品編號T1A，Cy3標(biāo)記，2型星形膠質(zhì)細(xì)胞（實驗組）樣品編

4、號T2A，Cy5標(biāo)記。1.3 細(xì)胞 總RNA提取 D-Hanks液洗滌純化培養(yǎng)的T1A和T2A，每10cm2細(xì)胞加入2ml Trizol試劑裂解細(xì)胞，使之充分溶解,分別轉(zhuǎn)移入 15 ml離心管，加入氯仿，1530放置3min，412000g/min離心15min,吸取上清分別至另一15ml離心管，加入異丙醇，1530放置10min，412000g/min離心10min,棄上清，加入75%乙醇，48000g/min離心10min，棄上清，超凈工作臺內(nèi)干燥沉淀，加入適量DEPC水完全溶解RNA沉淀，-80保存。1.4 探針標(biāo)記和雜交 （1）預(yù)雜交：預(yù)雜交液95水浴變性2 min，預(yù)雜交的玻片95水

5、浴變性30 s取出放入無水乙醇中30s，晾干后將變性的預(yù)雜交液加到玻片的點樣區(qū)域內(nèi)，蓋上蓋玻片，放入雜交箱內(nèi)42預(yù)雜交56h；（2）標(biāo)記探針：分別在2個 Eppendorf管中依次加入ddH2O 23l、逆轉(zhuǎn)錄引物5l和T1A或T2A總RNA 100g，反應(yīng)總體積50l?；靹蛑?0水浴10min，取出后迅速置冰，分別加入逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液10l、DTT 5l和dNTPs 4l，在暗室中加入逆轉(zhuǎn)錄酶2l和Cy3-dCTP（T1A管）或Cy5-dCTP（T2A管）3l，混勻樣品，室溫2min，42水浴2 h，加入標(biāo)記試劑I 4l，65水浴10 min后加入標(biāo)記試劑 II 4l，混勻，合并實驗組和對照組

6、，避光，真空抽干至50l，DNA純化柱純化DNA，加入標(biāo)記試劑III 8l，真空抽干；（3）雜交：在抽干的探針管中加入6.5l雜交試劑I，充分混勻至探針溶解，再加入6.5l雜交試劑II，混勻備用。將預(yù)雜交的玻片取出并去除蓋玻片，探針置95水浴變性2min取出后迅速置冰，玻片置95水浴變性30s取出浸入無水乙醇30s，將探針置于芯片上，蓋玻片覆蓋，置于雜交艙中并以Parafilm密封，42雜交箱內(nèi)雜交18h，取出玻片并去除蓋玻片，洗片劑洗滌后晾干掃描。1.5 雜交結(jié)果檢測和圖像分析 用ScanArray 4000掃描儀掃描芯片，通過芯片圖像分析軟件GenePix Pro3.0對芯片灰度掃描圖進行

7、分析。收集Cy3和Cy5熒光標(biāo)記信號值（基因點Cy3信號和Cy5信號各自的前景信號值減去它的背景信號值），將Cy5信號值小于200的以200取代以避免弱信號對實驗結(jié)果的干擾。為校正Cy5、Cy3標(biāo)記體系間的系統(tǒng)誤差，均對實驗數(shù)據(jù)進行均一化處理：計算每個有效基因點（Cy3、Cy5信號值皆大于200，或其中之一大于800；Cy5 /Cy3在0.110之間）的Ri（=Cy5 /Cy3）的自然對數(shù)值r = ln (Cy5 /Cy3)，算出全部有效基因點r的平均值r， 實驗的均一化系數(shù)ND就等于r的倒數(shù)即ND=EXP(r)。將所有基因點的Cy3信號值乘ND，得出調(diào)整后的Cy3*，將所有小于200的Cy3

8、*值以200取代以避免弱信號對實驗結(jié)果的干擾。計算每個基因點在本次實驗中的表達(dá)差異值Ratio（Cy5/Cy3*），Ratio2或0.5的數(shù)據(jù)項表示差異表達(dá)的基因。 2 結(jié)果2.1 總RNA提取 正常SD大鼠大腦1型和2型星形膠質(zhì)細(xì)胞總RNA提取結(jié)果：T1A總RNA及T2A總RNA電泳結(jié)果均可見清晰的18S和28S條帶，兩者亮度比為12，隱約可見5S條帶，表明RNA沒有降解，純度較高，符合實驗要求（圖1）。2.2 基因表達(dá)譜 基因芯片上測定了4096個點，包括1500條已知基因，2548條未報道基因，其中48個陰性對照點（8個水稻U2RNA基因點、8個HCV外殼蛋白基因點和32個空白點樣液點）

9、，實驗中這些點的雜交信號很低。經(jīng)過2次重復(fù)試驗，發(fā)現(xiàn)在T1A高表達(dá)(Ratio2.0)的基因分別有195條和244條。最后篩選出兩次試驗中均出現(xiàn)高表達(dá)的基因，它們在與兩種熒光標(biāo)記的探針雜交時表現(xiàn)出較大的差異，且上下調(diào)趨勢一致，程度相似，認(rèn)為它們是表達(dá)存在差異的基因，分別有113條和154條基因在T1A（Ratio2.0）中高表達(dá)。統(tǒng)計結(jié)果見表1，兩型星形膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)譜（圖2、圖3，見封三）。3 討論基因芯片是將大量的靶基因片段有序地、高密度地固定在玻璃、硅等載體上，以檢測不同樣本基因表達(dá)情況的一項技術(shù)。自1995年Stanford大學(xué)的Schena M等發(fā)表第一篇應(yīng)用基因芯片的論文以來，基

10、因芯片已廣泛用于基因功能的研究57。基因芯片技術(shù)大大推動了功能基因相關(guān)分子生物學(xué)的研究。基因表達(dá)譜芯片是目前應(yīng)用最廣泛的基因芯片，是將幾千個基因特異探針或其cDNA片段固定在一塊基因芯片上，對來源于不同個體（正常人與患者）、不同組織、不同細(xì)胞周期、不同發(fā)育階段、不同病變、不同刺激（包括不同誘導(dǎo)、不同治療手段）下的細(xì)胞內(nèi)的mRNA或逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進行檢測，從而大規(guī)模對這些基因表達(dá)的個體特異性、組織特異性、發(fā)育階段特異性、分化階段特異性、病變特異性、刺激特異性進行綜合的分析和判斷。與傳統(tǒng)研究基因表達(dá)差異的方法相比8，9，基因表達(dá)譜芯片具有許多優(yōu)點：檢測系統(tǒng)微型化，對樣品等需要量非常??；能同時研

11、究成千上萬條基因的表達(dá)變化，研究效率明顯提高；能更多地揭示基因之間表達(dá)變化的相互關(guān)系，從而研究基因與基因之間內(nèi)在作用關(guān)系；能更全面地研究某一表型或病癥的所有相關(guān)基因；檢測基因表達(dá)的靈敏度高。T1A和T2A在發(fā)生時間、細(xì)胞形態(tài)及功能等方面均有不同之處：(1) T1A見于胚胎16天，表達(dá)Cx4310、參與誘導(dǎo)血腦屏障的形成、表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物和參與神經(jīng)免疫等；(2) T2A見于生后14天，可合成硫酸軟骨素、聚積氨基丁酸、參與細(xì)胞外神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)，并圍繞在郎飛氏結(jié)周圍參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的形成11。本實驗室的研究也發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展亦與星形膠質(zhì)細(xì)胞譜系密切相關(guān)12。本研究應(yīng)用基因芯

12、片技術(shù)研究了兩型星形膠質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)譜，在較大的基因譜范圍分析了兩者在基因表達(dá)水平的差異。經(jīng)過2次重復(fù)，發(fā)現(xiàn)有267條基因的表達(dá)存在明顯的差異，其中154條在T2A中高表達(dá)，113條在T1A中高表達(dá)。這些差異表達(dá)基因是用傳統(tǒng)的研究方法所難以發(fā)現(xiàn)的，它們與星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生與分化、生長、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、離子轉(zhuǎn)運和細(xì)胞間信號傳導(dǎo)等有關(guān)。我們將進一步對這些差異表達(dá)的基因進行鑒定和功能分析，探討它們在兩型星形膠質(zhì)細(xì)胞各自生物學(xué)功能特性方面的作用，并為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)研究及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)疾病防治研究提供實驗依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Brown DR. A method for lon

13、g term culture of murine type 2 astrocytesJ. J Neurosci Methods, 1998,79:161-167.2 French-Constant C, Raff MC. The oligodendrocyte-type-2 astrocyte cell lineage is specialized for myelinationJ.Nature, 1986, 323: 335-338.3 Miller RH, Abney ER, David S, et al. Is reactive gliosis a property of a disti

14、nct subpopulation of astrocytesJ. J Neurosci, 1986, 6: 22-29.4 孫 燕, 王 劼, 夏春林. 新生大鼠大腦皮質(zhì)O2A 祖細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化J. 解剖學(xué)研究, 2004, 26(3):167-170.5 Schena M, Shalon D, Dais RW, et al. Quantitative monitoring of gene expression with a complementary DNA microarrayJ. Science, 1995, 270 (2):467-470.6 Schena M,Shalon D,

15、Heller R,et al.Parallel human genome analysis：Microarray-based expression monitoring of 1000 genesJ.Prog Nat Acad Sci, USA, 1996,93: 10614-10619.7 Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, et al. Molecular classification of cancer：Class discovery and class prediction by gene expression monitorJ. Science,1999,2

16、86(5439):531-537.8 Beattie JH. Obesity and hyperleptinemia in metallithionein null miceJ. Proc Nat Acad Sci, USA, 1998,95:358-363.9 Kuang WW, Thompson DA, Hoch RV, et al. Differential screening and suppression subtractive hybridization identified genes differentially expressed in an estrogen receptor-positive breast carcinoma cell lineJ. Nucleic Acid Res, 1998, 26(4):1116-1123.10 Belliveau DJ, Naus CC. Cortical type 2 astrocytes are not dye coupled nor do they express the major gap junction genes found in the central nervous systemJ. Glia, 1994, 12(1): 24-34.11 Aloisi F, Agr