第四章(質(zhì)粒載體)

1、第四章第四章 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 第一節(jié)第一節(jié) 質(zhì)粒載體概況質(zhì)粒載體概況 第二節(jié)第二節(jié) 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的復(fù)制與拷貝數(shù)的控制的復(fù)制與拷貝數(shù)的控制 第三節(jié)第三節(jié) 質(zhì)粒載體的構(gòu)建質(zhì)粒載體的構(gòu)建 第四節(jié)第四節(jié) 重要的質(zhì)粒載體重要的質(zhì)粒載體 第五節(jié)第五節(jié) 質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性問題質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性問題第一節(jié)第一節(jié) 質(zhì)粒載體的概況質(zhì)粒載體的概況 一一 質(zhì)粒的定義、命名、分類、分布質(zhì)粒的定義、命名、分類、分布 二二 質(zhì)粒的基本生物學(xué)特性質(zhì)粒的基本生物學(xué)特性 三三 質(zhì)粒的分離與純化質(zhì)粒的分離與純化 一、質(zhì)粒的定義、命名、分類、一、質(zhì)粒的定義、命名、分類、分布分布 定義：質(zhì)粒是一類寄宿于細(xì)胞內(nèi)，獨立定義：質(zhì)粒是一類寄宿

2、于細(xì)胞內(nèi)，獨立于染色體外的自我復(fù)制并穩(wěn)定遺傳的環(huán)于染色體外的自我復(fù)制并穩(wěn)定遺傳的環(huán)狀雙鏈狀雙鏈DNA分子。分子。 命名：小寫字母命名：小寫字母p代表質(zhì)粒，兩個大寫代表質(zhì)粒，兩個大寫字母代表發(fā)明者，后接實驗編號，字母代表發(fā)明者，后接實驗編號， 分類：分類： 分布：分布：1）根據(jù)質(zhì)粒的性狀特征）根據(jù)質(zhì)粒的性狀特征 F質(zhì)粒：質(zhì)粒：又叫又叫F因子或性質(zhì)粒因子或性質(zhì)粒(sexplasmid)。 R質(zhì)粒：質(zhì)粒：通稱抗藥性因子。編碼有一種或數(shù)通稱抗藥性因子。編碼有一種或數(shù) 種抗菌素抗性基因，種抗菌素抗性基因， Co1質(zhì)粒質(zhì)粒 ：產(chǎn)生大腸桿菌素因子。編碼產(chǎn)生大腸桿菌素因子。編碼 有控制大腸桿菌素合成的基因有控

3、制大腸桿菌素合成的基因質(zhì)粒分類質(zhì)粒分類 2）根據(jù)質(zhì)粒的傳遞性 3）根據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù) 4）根據(jù)質(zhì)粒和細(xì)菌的關(guān)系 4.質(zhì)粒分布、大小和數(shù)目二、質(zhì)粒的基本特性二、質(zhì)粒的基本特性 1.寄生性寄生性 2質(zhì)粒質(zhì)粒DNA構(gòu)型構(gòu)型 3質(zhì)粒質(zhì)粒DNA編碼的表型編碼的表型 4質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移 5質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的遷移作用的遷移作用 6質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的復(fù)制類型的復(fù)制類型 7質(zhì)粒的不親和性質(zhì)粒的不親和性 8. 其他特性其他特性 質(zhì)粒的基本生物學(xué)特性質(zhì)粒的基本生物學(xué)特性 1.寄生性寄生性 2質(zhì)質(zhì)粒粒DNA (圖圖41)大腸桿菌質(zhì)粒分子的結(jié)構(gòu)示意圖大腸桿菌質(zhì)粒分子的結(jié)構(gòu)示意圖質(zhì)粒質(zhì)粒DNA分子具有分子具有三種構(gòu)型

4、三種構(gòu)型 SC構(gòu)型構(gòu)型: 共價閉合環(huán)形共價閉合環(huán)形DNA(cccDNA)， 超螺旋的超螺旋的 SC構(gòu)型構(gòu)型； OC構(gòu)型構(gòu)型: 開環(huán)開環(huán)DNA(ocDNA)，OC構(gòu)型構(gòu)型； L構(gòu)型構(gòu)型: 發(fā)生雙鏈斷裂而形成線性分子發(fā)生雙鏈斷裂而形成線性分子 (LDNA)，L構(gòu)型構(gòu)型。（圖。（圖42）環(huán)形雙鏈環(huán)形雙鏈DNA質(zhì)粒分子的三種構(gòu)型質(zhì)粒分子的三種構(gòu)型 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分子構(gòu)型的分子構(gòu)型 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA瓊脂瓊脂糖糖 凝膠電泳模式圖凝膠電泳模式圖 (a) (b)OC SCL3.質(zhì)粒質(zhì)粒DNA編碼的表型編碼的表型 抗性特征抗性特征、代謝特征代謝特征、修飾寄主生活方式的因子修飾寄主生活方式的因子， 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA

5、編碼的基因有編碼的基因有產(chǎn)生抗菌素的基因產(chǎn)生抗菌素的基因、芳香族化合物降解基因芳香族化合物降解基因、糖酵解基因、產(chǎn)生腸毒糖酵解基因、產(chǎn)生腸毒素基因、重金屬抗性基因、產(chǎn)生細(xì)菌素的基因、素基因、重金屬抗性基因、產(chǎn)生細(xì)菌素的基因、誘發(fā)植物腫瘤基因、產(chǎn)生硫化氫基因，以及寄主誘發(fā)植物腫瘤基因、產(chǎn)生硫化氫基因，以及寄主控制的限制與修飾系統(tǒng)的基因等控制的限制與修飾系統(tǒng)的基因等4質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移 (1) 接合型質(zhì)粒的自我傳遞接合型質(zhì)粒的自我傳遞 (2) F質(zhì)粒質(zhì)粒 (3 )質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的接合轉(zhuǎn)移的接合轉(zhuǎn)移 細(xì)胞交配對的形成細(xì)胞交配對的形成 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移細(xì)菌的接合作用細(xì)菌的接合作用 在

6、合適的條件下，雄性細(xì)胞和雌性在合適的條件下，雄性細(xì)胞和雌性細(xì)胞混合培養(yǎng)，形成細(xì)胞混合培養(yǎng)，形成 雌雌雄細(xì)胞配對過雄細(xì)胞配對過程為細(xì)菌的接合作用程為細(xì)菌的接合作用(conjugation)。 在雌雄細(xì)胞配對期間，雄性細(xì)胞中在雌雄細(xì)胞配對期間，雄性細(xì)胞中的的F因子按滾環(huán)復(fù)制模式因子按滾環(huán)復(fù)制模式(rolling circle replication model)，(1) 接合型質(zhì)粒的自我傳遞接合型質(zhì)粒的自我傳遞 格蘭氏陰性細(xì)菌的質(zhì)粒分成接合型和非接合型。格蘭氏陰性細(xì)菌的質(zhì)粒分成接合型和非接合型。 接合型的質(zhì)粒接合型的質(zhì)粒(conjugative plasmid)，又叫自我轉(zhuǎn)，又叫自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒。除

7、了具有自主復(fù)制所必須的遺傳信息之外，移的質(zhì)粒。除了具有自主復(fù)制所必須的遺傳信息之外，還帶有一套控制細(xì)菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。還帶有一套控制細(xì)菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。 非接合型的質(zhì)粒非接合型的質(zhì)粒(nonconjugative plasmid)，不能，不能自我轉(zhuǎn)移是因為沒有了控制細(xì)胞配對和接合轉(zhuǎn)移的基因。自我轉(zhuǎn)移是因為沒有了控制細(xì)胞配對和接合轉(zhuǎn)移的基因。(2)F質(zhì)粒質(zhì)粒 又叫又叫F因子因子(ferti1ity factor) ，單拷貝的接合型質(zhì)粒，單拷貝的接合型質(zhì)粒，其分子量約為其分子量約為94kb，共編碼，共編碼19個轉(zhuǎn)移基因個轉(zhuǎn)移基因(tra)。F質(zhì)粒質(zhì)粒有三種存在方式：有三種存在方

8、式： (i)以染色體外環(huán)形雙鏈質(zhì)粒以染色體外環(huán)形雙鏈質(zhì)粒DNA形式存在，不帶形式存在，不帶有染色體的基因或有染色體的基因或DNA區(qū)段。這樣的細(xì)胞叫做區(qū)段。這樣的細(xì)胞叫做F+細(xì)胞。細(xì)胞。 (ii)以染色體外環(huán)形雙鏈質(zhì)粒以染色體外環(huán)形雙鏈質(zhì)粒DNA形式存在，同時還攜形式存在，同時還攜帶著細(xì)菌的染色體基因或帶著細(xì)菌的染色體基因或DNA區(qū)段。這樣的細(xì)胞叫做區(qū)段。這樣的細(xì)胞叫做F細(xì)胞。細(xì)胞。 (iii)以線性以線性DNA形式從不同位點整合到寄主染色形式從不同位點整合到寄主染色體上，這樣的細(xì)胞叫做體上，這樣的細(xì)胞叫做Hfr細(xì)胞細(xì)胞(高頻重組細(xì)胞高頻重組細(xì)胞)。大腸桿菌大腸桿菌F因子基因圖因子基因圖(3)質(zhì)

9、粒質(zhì)粒DNA的接合轉(zhuǎn)移機制的接合轉(zhuǎn)移機制 細(xì)胞交配對的形成：細(xì)胞交配對的形成： 大腸桿菌大腸桿菌F質(zhì)粒編質(zhì)粒編碼的特異性性須，在受體細(xì)胞的識別以及在確立碼的特異性性須，在受體細(xì)胞的識別以及在確立配對細(xì)胞之間的表面接觸中起著重要的作用。它配對細(xì)胞之間的表面接觸中起著重要的作用。它至少需要至少需要25種以上的轉(zhuǎn)移基因編碼產(chǎn)物的參與。種以上的轉(zhuǎn)移基因編碼產(chǎn)物的參與。 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移F質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移是從的轉(zhuǎn)移是從轉(zhuǎn)移起點轉(zhuǎn)移起點oriT開始的。開始的。 大腸桿菌大腸桿菌F質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)結(jié)構(gòu)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)結(jié)構(gòu)-該區(qū)編碼著控制細(xì)胞接合作用的基因該區(qū)編碼著控制細(xì)胞接合作用的基因質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的接合

10、轉(zhuǎn)移及復(fù)制的接合轉(zhuǎn)移及復(fù)制 5質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的遷移作用的遷移作用 共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程，叫做質(zhì)粒的遷移作用。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程，叫做質(zhì)粒的遷移作用。F因子帶動因子帶動Co1E1質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的條件質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的條件6.質(zhì)粒的復(fù)制類型質(zhì)粒的復(fù)制類型 兩種不同的復(fù)制型：兩種不同的復(fù)制型： “嚴(yán)緊型嚴(yán)緊型” (stringentplasmid)； “松馳型松馳型” (relaxedplasmid)。 質(zhì)?？截悢?shù)的定義：質(zhì)?？截悢?shù)的定義： 每個細(xì)菌細(xì)胞中所含有的質(zhì)粒每個細(xì)菌細(xì)胞中所含有的質(zhì)粒DNA 分子的數(shù)目分子的數(shù)目7質(zhì)粒質(zhì)粒的不親和性的不親和性 (1) 質(zhì)粒

11、的不親和性現(xiàn)象質(zhì)粒的不親和性現(xiàn)象 (2) 質(zhì)粒不親和性的分子基礎(chǔ)質(zhì)粒不親和性的分子基礎(chǔ)8.質(zhì)粒的其他特性質(zhì)粒的其他特性 穩(wěn)定性：維持一定的拷貝數(shù)穩(wěn)定性：維持一定的拷貝數(shù) 同源性：不同的質(zhì)粒有相同的同源區(qū)同源性：不同的質(zhì)粒有相同的同源區(qū) 重組性：質(zhì)粒間、質(zhì)粒同染色體間重組重組性：質(zhì)粒間、質(zhì)粒同染色體間重組 消除和恢復(fù)性等特性消除和恢復(fù)性等特性三三.質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離與純化的分離與純化 1氯化銫密度梯度離心法氯化銫密度梯度離心法 2堿變性法堿變性法 3微量堿變性法微量堿變性法 4影響質(zhì)粒影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素產(chǎn)量的因素 (1)寄主菌株的遺傳背景寄主菌株的遺傳背景 (2)質(zhì)粒的拷貝數(shù)及分子大小質(zhì)

12、粒的拷貝數(shù)及分子大小 1氯化銫密度梯度離心法氯化銫密度梯度離心法 2堿變性法堿變性法 3微量堿變性法微量堿變性法 4影響質(zhì)粒影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素產(chǎn)量的因素 (1) 寄主菌株的遺傳背景寄主菌株的遺傳背景 (2) 質(zhì)粒的拷貝數(shù)及分子大小質(zhì)粒的拷貝數(shù)及分子大小分離純化質(zhì)粒分離純化質(zhì)粒DNA的程序的程序寄主菌株的遺傳背景寄主菌株的遺傳背景 使用使用endA基因發(fā)生突變基因發(fā)生突變的的(endAl)大腸桿大腸桿菌寄主菌株，菌寄主菌株， endA基因突變，使大腸桿菌寄主細(xì)胞失去基因突變，使大腸桿菌寄主細(xì)胞失去了合成具有功能活性的核酸內(nèi)切酶了合成具有功能活性的核酸內(nèi)切酶I的能力，的能力，增進(jìn)了質(zhì)粒增進(jìn)了

13、質(zhì)粒DNA分子的穩(wěn)定性。分子的穩(wěn)定性。第二節(jié)第二節(jié) 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的復(fù)制與的復(fù)制與 拷貝數(shù)的控制拷貝數(shù)的控制 1質(zhì)粒質(zhì)粒DNA復(fù)制的多樣性復(fù)制的多樣性 2ColEl質(zhì)粒質(zhì)粒DNA復(fù)制的啟動復(fù)制的啟動 3質(zhì)粒質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)的控制拷貝數(shù)的控制 (1)天然質(zhì)粒拷貝數(shù)的控制天然質(zhì)?？截悢?shù)的控制 (2)雜種質(zhì)?？截悢?shù)的控制雜種質(zhì)粒拷貝數(shù)的控制 4質(zhì)粒復(fù)制控制的分子模型質(zhì)粒復(fù)制控制的分子模型 (1)抑制蛋白質(zhì)稀釋模型抑制蛋白質(zhì)稀釋模型 (2)自體阻遏蛋白質(zhì)模型自體阻遏蛋白質(zhì)模型質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的復(fù)制與拷貝數(shù)的控制的復(fù)制與拷貝數(shù)的控制 1質(zhì)粒質(zhì)粒DNA復(fù)制的多樣性復(fù)制的多樣性 (i) 對寄主酶的依賴性對寄主

14、酶的依賴性 (ii) DNA聚合酶的利用聚合酶的利用 (iii) 復(fù)制的方向性復(fù)制的方向性 (iv) 復(fù)制的終止復(fù)制的終止 (v) 復(fù)制復(fù)制型型 2ColE1質(zhì)粒質(zhì)粒DNA復(fù)制的啟動復(fù)制的啟動 3質(zhì)粒質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)的控制拷貝數(shù)的控制 (1)天然質(zhì)粒拷貝數(shù)的控制天然質(zhì)?？截悢?shù)的控制 (2)雜種質(zhì)?？截悢?shù)的控制雜種質(zhì)?？截悢?shù)的控制Co1El、pSCl 01及其雜種質(zhì)粒及其雜種質(zhì)粒pSCl34的的DNA復(fù)制復(fù)制 4質(zhì)粒復(fù)制控制的分子模型質(zhì)粒復(fù)制控制的分子模型 (1)抑制蛋白質(zhì)稀釋模型抑制蛋白質(zhì)稀釋模型 (2)自體阻遏蛋白質(zhì)模型自體阻遏蛋白質(zhì)模型質(zhì)粒質(zhì)粒DNA復(fù)制控制的抑制蛋白復(fù)制控制的抑制蛋白質(zhì)稀

15、釋模型質(zhì)稀釋模型質(zhì)粒質(zhì)粒DNA復(fù)制控制的自體阻遏復(fù)制控制的自體阻遏蛋白質(zhì)模型蛋白質(zhì)模型第三節(jié)質(zhì)粒載體的第三節(jié)質(zhì)粒載體的構(gòu)建構(gòu)建 1天然質(zhì)粒用作克隆載體的局限性天然質(zhì)粒用作克隆載體的局限性 2質(zhì)粒載體必須具備的基本條件質(zhì)粒載體必須具備的基本條件 3質(zhì)粒載體的選擇記號質(zhì)粒載體的選擇記號 4不同類型的質(zhì)粒載體不同類型的質(zhì)粒載體 (1)高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 (2)低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 (3)失控的質(zhì)粒載體失控的質(zhì)粒載體 (4)插入失活型的質(zhì)粒載體插入失活型的質(zhì)粒載體 (5)正選擇的質(zhì)粒載體正選擇的質(zhì)粒載體 (6)表達(dá)型的質(zhì)粒載體表達(dá)型的質(zhì)粒載體1 天然質(zhì)粒用作克隆載體的

16、局限性天然質(zhì)粒用作克隆載體的局限性 天然質(zhì)粒有天然質(zhì)粒有 Co1E1、RSF2124和和PSCl01等。天然質(zhì)粒的局限性：如質(zhì)粒等。天然質(zhì)粒的局限性：如質(zhì)粒的分子量較大，拷貝數(shù)較低，只有一個的分子量較大，拷貝數(shù)較低，只有一個抗菌素抗性基因，無法使用插入失活技抗菌素抗性基因，無法使用插入失活技術(shù)選擇重組體分子術(shù)選擇重組體分子等。等。 2質(zhì)粒載體必須具備的基本條件質(zhì)粒載體必須具備的基本條件 (i)具有復(fù)制起點具有復(fù)制起點 (ii)具有可具有可選擇的標(biāo)記選擇的標(biāo)記 (iii)具有若干限制酶單一識別位點具有若干限制酶單一識別位點 (iv)具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù) (

17、v)作為表達(dá)載體還有啟動子，轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)移信號，作為表達(dá)載體還有啟動子，轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)移信號，終止子序列等片段。終止子序列等片段。3質(zhì)粒載體的選擇記號質(zhì)粒載體的選擇記號 在基因克隆中采用的質(zhì)粒載體的選在基因克隆中采用的質(zhì)粒載體的選擇記號，有新陳代謝特性、對大腸桿菌擇記號，有新陳代謝特性、對大腸桿菌素素E1 的免疫性，抗菌素抗性等。使用抗的免疫性，抗菌素抗性等。使用抗菌素抗性記號有四環(huán)素抗性、氨芐青霉菌素抗性記號有四環(huán)素抗性、氨芐青霉素抗性、鏈霉素抗性，卡那霉素抗性等素抗性、鏈霉素抗性，卡那霉素抗性等正選擇質(zhì)粒載體正選擇質(zhì)粒載體PKN80的形體的形體圖圖4不同類型的質(zhì)粒載體不同類型的質(zhì)粒載體 (1)高拷貝數(shù)的

18、質(zhì)粒載體高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 (2)低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 (3)失控的質(zhì)粒載體失控的質(zhì)粒載體 (4)插入失活型的質(zhì)粒載體插入失活型的質(zhì)粒載體 (5)正選擇的質(zhì)粒載體正選擇的質(zhì)粒載體 (6)表達(dá)型的質(zhì)粒載體表達(dá)型的質(zhì)粒載體 復(fù)制基因復(fù)制基因(replicator) 選擇性記號選擇性記號 克隆位點克隆位點 基因克隆質(zhì)粒載體的三種組成基因克隆質(zhì)粒載體的三種組成二、構(gòu)建載體的一般程序二、構(gòu)建載體的一般程序 1.根據(jù)原則設(shè)計根據(jù)原則設(shè)計 2.分離純化分離純化DNA片段片段 3.DNA片段連接重組片段連接重組 4.重組連接液轉(zhuǎn)化重組連接液轉(zhuǎn)化 5.篩選重組轉(zhuǎn)化子篩選重組轉(zhuǎn)化子 6.載體的有關(guān)

19、載體的有關(guān)DNA序列分析序列分析 第四節(jié)重要的質(zhì)粒載體第四節(jié)重要的質(zhì)粒載體 一一.大腸桿菌質(zhì)粒載體大腸桿菌質(zhì)粒載體 1pSCl01質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 2Co1E1質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 3pBR322質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 4pUC質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 5喪失遷移功能的質(zhì)粒載體喪失遷移功能的質(zhì)粒載體 6.能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體 一種典型的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒載體的形體圖一種典型的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒載體的形體圖二、酵母菌質(zhì)粒載體（穿梭質(zhì)二、酵母菌質(zhì)粒載體（穿梭質(zhì)粒）粒） 酵母酵母2質(zhì)粒質(zhì)粒 乳酸克魯維酵母中的線性質(zhì)粒乳酸克魯維酵母中的線性質(zhì)粒 大腸桿菌酵母穿梭質(zhì)粒大腸桿菌酵母穿

20、梭質(zhì)粒 酵母表達(dá)型質(zhì)粒酵母表達(dá)型質(zhì)粒 酵母分泌型表達(dá)質(zhì)粒酵母分泌型表達(dá)質(zhì)粒 酵母人工染色體酵母人工染色體YAC 1pSCl01質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 2CoEEl質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 pSCl01質(zhì)粒作載體克隆非洲爪贍的基因質(zhì)粒作載體克隆非洲爪贍的基因 3pBR322質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 (1)pBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建質(zhì)粒載體的構(gòu)建 (2)pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點質(zhì)粒載體的優(yōu)點 具有較小的分子量具有較小的分子量 具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn) 化子的選擇記號。化子的選擇記號。 具較高的拷貝數(shù)具較高的拷貝數(shù) (3)pBR322質(zhì)粒載體的改良質(zhì)粒載體的改良 pBR322質(zhì)粒載體

21、的構(gòu)建過程質(zhì)粒載體的構(gòu)建過程pBR322質(zhì)粒載體的形體圖質(zhì)粒載體的形體圖pBR322質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)來源質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)來源pBR322質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體tet 基因的插入失活效應(yīng)基因的插入失活效應(yīng)pBH20pBR322EcoRIEcoRIKlenowHaeHaeEcoRIEcoRIplacHaeIIIHindIIIBamHIHhalacHindIIIEcoRIligationpBH20HindIIIBamHIHhalacHindIIIEcoRIEcoRIBamHISamastetinBamHIEcoRIligationpsomIHindIIIEcoRIBamHISamastetinHhalacPs

22、tIlacpsomIHindIIIEcoRIBamHISamastetinHhaPstIpBR322PstIEcoRIAmpEcoRIPstIEcoRIPstIpSomIIPstIEcoRIBamHIAmpSomastetinligationpSomIIEcoRIBamHIAmpSomastetinPstIEcoRIEcoRILac-gal-3EcoRIEcoRIligationpSomIIILac-galsomastetin4pUC質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 (1)pUC質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu) (2)pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點質(zhì)粒載體的優(yōu)點 第一，具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)第一，具有更小的分子量和

23、更高的拷貝數(shù) 第二，適用于組織化學(xué)方法檢測重組體第二，適用于組織化學(xué)方法檢測重組體 第三，具有多克隆位點第三，具有多克隆位點MCS區(qū)段區(qū)段pUCl8及及PUCl9質(zhì)粒載體的形體圖質(zhì)粒載體的形體圖喪失遷移功能的喪失遷移功能的pBR327質(zhì)粒載體的形體質(zhì)粒載體的形體圖圖5其它重要的質(zhì)粒載體其它重要的質(zhì)粒載體 (1)喪失遷移功能的質(zhì)粒載體喪失遷移功能的質(zhì)粒載體 擁有較高水平的拷貝數(shù)擁有較高水平的拷貝數(shù) 失去了失去了bom位點，即便在共存的位點，即便在共存的F質(zhì)粒提質(zhì)粒提供轉(zhuǎn)移裝置的條件下，也不可能發(fā)生遷移作供轉(zhuǎn)移裝置的條件下，也不可能發(fā)生遷移作用。用。 (2)能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體能在體外轉(zhuǎn)

24、錄克隆基因的質(zhì)粒載體pSP64質(zhì)粒載體的形體質(zhì)粒載體的形體圖圖pSP64與與PSP65質(zhì)粒載體的多克隆位質(zhì)粒載體的多克隆位點區(qū)的核苷酸序列結(jié)構(gòu)點區(qū)的核苷酸序列結(jié)構(gòu)(3)穿梭質(zhì)粒載體穿梭質(zhì)粒載體 穿梭質(zhì)粒載體穿梭質(zhì)粒載體(shuttleplasmidvector)，是指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)是指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點和選擇記號，在兩種不同的寄主制起點和選擇記號，在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。 穿梭質(zhì)粒載體，有大腸桿菌穿梭質(zhì)粒載體，有大腸桿菌枯草枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒載體，大腸桿菌芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒載體，大腸桿菌釀釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體。酒

25、酵母穿梭質(zhì)粒載體。大腸桿菌大腸桿菌釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體第六節(jié)質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性問題第六節(jié)質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性問題 1質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的類型質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的類型 (1)結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性 (2)分離的不穩(wěn)定性分離的不穩(wěn)定性 2影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素 (1)新陳代謝負(fù)荷新陳代謝負(fù)荷 (2)拷貝數(shù)差度拷貝數(shù)差度 (3)寄主重組體系寄主重組體系 3隨機分配的分子機理隨機分配的分子機理 (1)控制環(huán)路使質(zhì)粒拷貝數(shù)的限制在最低的水平控制環(huán)路使質(zhì)?？截悢?shù)的限制在最低的水平 (2)位點特異的重組作用消除質(zhì)粒的寡聚體位點特異的重組作用消除質(zhì)粒的寡聚體

26、(3)調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂活動阻止無質(zhì)粒細(xì)胞的產(chǎn)生調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂活動阻止無質(zhì)粒細(xì)胞的產(chǎn)生 (4)大腸桿菌素的合成增進(jìn)了質(zhì)粒的穩(wěn)定性大腸桿菌素的合成增進(jìn)了質(zhì)粒的穩(wěn)定性 4主動分配的分子機理主動分配的分子機理 (1)分配區(qū)的結(jié)構(gòu)與功能分配區(qū)的結(jié)構(gòu)與功能 (2)預(yù)配對模型預(yù)配對模型 (3)二聚體的解離有助于質(zhì)粒的主動分配二聚體的解離有助于質(zhì)粒的主動分配 (4)寄主致死功能對質(zhì)粒穩(wěn)定性的效應(yīng)寄主致死功能對質(zhì)粒穩(wěn)定性的效應(yīng) 1質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的類型質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的類型 質(zhì)粒的不穩(wěn)定性質(zhì)粒的不穩(wěn)定性(plasmid instability)，包括，包括分離的不穩(wěn)定性分離的不穩(wěn)定性(segrega tional

27、instability)和結(jié)和結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性構(gòu)的不穩(wěn)定性(structuralinstability) (1)結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性 DNA的缺失、插入和重排都是造成質(zhì)粒載體的缺失、插入和重排都是造成質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性的原因。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性的原因。 (2)分離的不穩(wěn)定性分離的不穩(wěn)定性 在細(xì)胞分裂過程中發(fā)生的質(zhì)粒不平均的分配，在細(xì)胞分裂過程中發(fā)生的質(zhì)粒不平均的分配，也是導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定性的重要原因。也是導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定性的重要原因。2影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素 (1)新陳代謝負(fù)荷對質(zhì)粒載體穩(wěn)定性新陳代謝負(fù)荷對質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)的效應(yīng) (2)拷貝數(shù)差度對質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的拷貝數(shù)差度對質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的影響影響 (3)寄主重組體系對質(zhì)粒載體穩(wěn)定性寄主重組體系對質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)的效應(yīng)在細(xì)胞分裂過程中質(zhì)粒的分配方式