第二章生物制品的制備ppt課件

1、 第二章 生物制品的制備 （Preparation） 第一節(jié) 一般生物制品的制備方法 (Preparation of general bio-preparate )一、生物制品原料的選擇、預處理與保存方法 （Selection、pretreatment and preservation of raw material of biopreparate） （1 1原料選擇原料選擇 原料的選擇原則：原料的選擇原則： 有效成分含量高，新穎；有效成分含量高，新穎； 原料來源豐富，產(chǎn)地較近；原料來源豐富，產(chǎn)地較近； 原料中雜質(zhì)含量少；原料中雜質(zhì)含量少； 原料成本低等。原料成本低等。原料的選擇注意事項：原料

2、的選擇注意事項： 植物原料生長的季節(jié)性；植物原料生長的季節(jié)性； 微生物原料的對數(shù)期；微生物原料的對數(shù)期； 動物原料的年齡與性別。動物原料的年齡與性別。（2 2原料的預處理與保存：原料的預處理與保存： 動物原料：采集后要立即處理，去動物原料：采集后要立即處理，去除結(jié)締組織、脂肪組織等，并迅速冷除結(jié)締組織、脂肪組織等，并迅速冷凍貯存。凍貯存。植物原料：要擇時采集并就地去除植物原料：要擇時采集并就地去除不用的部分，保鮮處理；不用的部分，保鮮處理；微生物原料：要及時將菌細胞與培微生物原料：要及時將菌細胞與培養(yǎng)液分開，進行保鮮處理。養(yǎng)液分開，進行保鮮處理。 原料的保存方法主要有：原料的保存方法主要有：冷

3、凍法。該方法適用于所有生物原冷凍法。該方法適用于所有生物原料。常用料。常用-40-40速凍。速凍。有機溶劑脫水法。常用的有機溶劑有機溶劑脫水法。常用的有機溶劑是丙酮。該法適用于原料少而價值高是丙酮。該法適用于原料少而價值高、有機溶劑對活性物質(zhì)沒有破壞作用、有機溶劑對活性物質(zhì)沒有破壞作用的原料，如腦垂體等。的原料，如腦垂體等。防腐劑保鮮。常用乙醇、苯酚等。防腐劑保鮮。常用乙醇、苯酚等。該法適用于液體原料，如發(fā)酵液、提該法適用于液體原料，如發(fā)酵液、提取液等。取液等。 二、生物制品的提取二、生物制品的提取extractionextraction） (1)(1)生物組織與細胞的破碎生物組織與細胞的破碎

4、obtrude obtrude of tissue and cellof tissue and cell）：生物制品大部分）：生物制品大部分存在于生物組織或細胞中，要提高提取率存在于生物組織或細胞中，要提高提取率，破碎過程是非常重要的。常用的破碎方，破碎過程是非常重要的。常用的破碎方法：法： 磨切法，該法屬于機械破碎方法，設備磨切法，該法屬于機械破碎方法，設備有組織搗碎機、膠體磨、勻漿器、勻質(zhì)機有組織搗碎機、膠體磨、勻漿器、勻質(zhì)機、球磨機、乳缽等。、球磨機、乳缽等。壓力法，有加壓、減壓、滲透壓三種壓力法，有加壓、減壓、滲透壓三種 反復凍融法，設備簡便，活性保反復凍融法，設備簡便，活性保持好，但

5、用時較長。持好，但用時較長。超聲波振蕩破碎法，該方法破碎超聲波振蕩破碎法，該方法破碎效果較好，但由于局部發(fā)熱，對效果較好，但由于局部發(fā)熱，對活性有損失?；钚杂袚p失。自溶法或酶解法，用得較少。自溶法或酶解法，用得較少。（2 2提取提取extractionextraction） 生物組織與細胞破碎后要立即進行提取生物組織與細胞破碎后要立即進行提取。提取時，首先要根據(jù)活性物質(zhì)的性質(zhì)，。提取時，首先要根據(jù)活性物質(zhì)的性質(zhì)， 選擇提取試劑。提取試劑主要有：水、選擇提取試劑。提取試劑主要有：水、緩沖溶液、鹽溶液、乙醇、其他有機溶劑緩沖溶液、鹽溶液、乙醇、其他有機溶劑如氯仿、丙酮等）。如氯仿、丙酮等）。 考慮

6、提取溶劑的用量及提取次數(shù)、提取考慮提取溶劑的用量及提取次數(shù)、提取時間。時間。 注意提取的溫度、注意提取的溫度、pHpH、變性劑等因素。、變性劑等因素。 三、蛋白質(zhì)類制品的分離純化方法三、蛋白質(zhì)類制品的分離純化方法Isolation and depuration of protein Isolation and depuration of protein productionproduction） 包括蛋白質(zhì)、多肽和酶類等藥物。分包括蛋白質(zhì)、多肽和酶類等藥物。分離純化方法有：離純化方法有： (1)(1)沉淀法沉淀法precipitationprecipitation）：蛋白質(zhì)、）：蛋白質(zhì)、酶的初

7、步純化往往用沉淀法。原理是使蛋酶的初步純化往往用沉淀法。原理是使蛋白質(zhì)膠體顆粒破壞，從而沉淀蛋白質(zhì)。常白質(zhì)膠體顆粒破壞，從而沉淀蛋白質(zhì)。常用的有鹽析法用的有鹽析法salting outsalting out）、有機溶）、有機溶劑沉淀法劑沉淀法organic solvent organic solvent precipitationprecipitation）、等電點沉淀法）、等電點沉淀法isoelectric precipitationisoelectric precipitation）、與靶物）、與靶物質(zhì)結(jié)合沉淀法如抗體質(zhì)結(jié)合沉淀法如抗體抗原）（抗原）（target target bandi

8、ng precipitationbanding precipitation等。等。 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)中性鹽中和電荷中和電荷水化層減弱水化層減弱溶解度下溶解度下降，沉淀降，沉淀鹽析法原理鹽析法原理等電點沉淀法等電點沉淀法在等電點時，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零(即正負電荷相等)，此時蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點時，其溶解度最小，最易形成沉淀物。(2) (2) 按分子大小分離的方法：有超濾法按分子大小分離的方法：有超濾法ultrafiltrationultrafiltration和透折法和

9、透折法dialysisdialysis）（即膜分離方法）、凝膠層析法）（即膜分離方法）、凝膠層析法gel gel chromatographychromatography）、超速離心法）、超速離心法ultra ultra centrifugationcentrifugation轉(zhuǎn)速大于轉(zhuǎn)速大于20 000r/min20 000r/min等。其中膜分離法可用于生物大分子物質(zhì)等。其中膜分離法可用于生物大分子物質(zhì)的濃縮、分級和脫鹽。的濃縮、分級和脫鹽。 凝膠層析又稱分子篩層析，主要根據(jù)混合物中分子的大小和形凝膠層析又稱分子篩層析，主要根據(jù)混合物中分子的大小和形狀不同狀不同 ，在通過凝膠時，分子的擴散

10、速率各異而達到分離的，在通過凝膠時，分子的擴散速率各異而達到分離的目的。凝膠顆粒具有多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子易進入凝膠網(wǎng)孔，目的。凝膠顆粒具有多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子易進入凝膠網(wǎng)孔，流程長而移動速度慢，而大分子物質(zhì)不能進入凝膠網(wǎng)孔，沿凝流程長而移動速度慢，而大分子物質(zhì)不能進入凝膠網(wǎng)孔，沿凝膠顆粒間隙流動，流程短移動快。這種現(xiàn)象稱為分子篩效應。膠顆粒間隙流動，流程短移動快。這種現(xiàn)象稱為分子篩效應。(3)(3)按分子所帶電荷進行分離的方法按分子所帶電荷進行分離的方法氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶均為兩性電解質(zhì)氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶均為兩性電解質(zhì)。它們具有等電點，在離開等電點的。它們具有等電點，在離開等電點

11、的pHpH時便時便會帶正或負電荷。例如某蛋白質(zhì)等電點為會帶正或負電荷。例如某蛋白質(zhì)等電點為7.07.0，當溶液，當溶液pHpH為為4.04.0時，分子則帶有正電荷時，分子則帶有正電荷。由于具有該性質(zhì)，利用帶電性質(zhì)進行分離。由于具有該性質(zhì)，利用帶電性質(zhì)進行分離是極其有效的方法。利用電學性質(zhì)進行分離是極其有效的方法。利用電學性質(zhì)進行分離的方法有離子交換柱層析法的方法有離子交換柱層析法ion-exchange ion-exchange c h r o m a t o g r a p h yc h r o m a t o g r a p h y ） 、 電 泳 法 ） 、 電 泳 法 electrop

12、horesiselectrophoresis）、等電聚焦法）、等電聚焦法isoelectric focusingisoelectric focusing等。等。（4 4親和層析法親和層析法affinity chromatographyaffinity chromatography）大部分生物活性物質(zhì)都有其作用的靶物質(zhì)，如大部分生物活性物質(zhì)都有其作用的靶物質(zhì)，如酶與底物或抑制劑）、抗原與抗體、激素與酶與底物或抑制劑）、抗原與抗體、激素與受體等，它們之間有特異的親合作用，利用該受體等，它們之間有特異的親合作用，利用該性質(zhì)設計的特異層析分離技術(shù)稱為親和層析。性質(zhì)設計的特異層析分離技術(shù)稱為親和層析。親

13、和層析分離專一性強，操作簡便，是當前應親和層析分離專一性強，操作簡便，是當前應用很廣泛的分離方法之一。用很廣泛的分離方法之一。親和色譜親和色譜affinity chromatography） 1基本概念基本概念basic concept）親和層析是利用待分離物質(zhì)與其特異性配基之親和層析是利用待分離物質(zhì)與其特異性配基之間特異性的親和力進行分離的一類特殊的層析間特異性的親和力進行分離的一類特殊的層析技術(shù)。技術(shù)。配基配基ligand） ：被固定在基質(zhì)上的分子稱為：被固定在基質(zhì)上的分子稱為配基，配基和基質(zhì)是以共價鍵結(jié)合的。配基，配基和基質(zhì)是以共價鍵結(jié)合的?；|(zhì)基質(zhì)matrix）：亦稱為載體）：亦稱為載

14、體vector），是構(gòu)），是構(gòu)成固定相的骨架成固定相的骨架 。2親和層析有如下特點親和層析有如下特點Characteristics of Affinity Chromatography） 純化過程簡單、迅速；純化過程簡單、迅速； 分離效率高；分離效率高； 產(chǎn)物純度高；產(chǎn)物純度高； 必須針對某一分離對象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定必須針對某一分離對象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件。的層析條件。 因此應用范圍受到一定的限制。因此應用范圍受到一定的限制。3親和層析的基本原理親和層析的基本原理（Mechanism of Affinity Chromatography）親和的一對分子中的一方以共價鍵親和

15、的一對分子中的一方以共價鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑。劑。當含有混合組份的樣品流動相當含有混合組份的樣品流動相通過此固定相時，只有和固定相分子有通過此固定相時，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附結(jié)合，其它沒有親和力的無關(guān)組份就隨結(jié)合，其它沒有親和力的無關(guān)組份就隨流動相流出。流動相流出。然后改變流動相成份，將結(jié)合的親然后改變流動相成份，將結(jié)合的親和物洗脫下來。（見和物洗脫下來。（見Fig1、Fig2）。）。（ Fig1. Mechanism of AC）（Fig2. Mechanism of AC）抗

16、原專一抗體基質(zhì)具有特異性親和作用的生物分子具有特異性親和作用的生物分子4配基的種類配基的種類 (sorts of ligand)抗原與抗體?？乖c抗體。DNA與互補與互補DNA或或RNAcDNA、mRNA)。酶與其底物。酶與其底物。激素與其受體。激素與其受體。維生素與結(jié)合蛋白。維生素與結(jié)合蛋白。糖蛋白與植物凝集素。糖蛋白與植物凝集素。5親和層析載體的性質(zhì)與選擇親和層析載體的性質(zhì)與選擇親和層析載體的選擇親和層析載體的選擇selection of vectors）多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能使被親和吸附的大多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能使被親和吸附的大分子自由通過。分子自由通過。顆粒均勻，具有良好的流速。顆粒均

17、勻，具有良好的流速。具有惰性，盡量減少非專一性吸附。具有惰性，盡量減少非專一性吸附。在溫和的條件下在溫和的條件下 能與配基共價偶聯(lián)。能與配基共價偶聯(lián)。6常用的親和層析載體常用的親和層析載體 （Vectors of Affinity Chromatography）纖維素纖維素cellulose）葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠Sephadex）瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠Sepharose）聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠Bio-gel）多孔玻璃珠多孔玻璃珠Bio-Glass）其它新型載體其它新型載體Other gels）7親和層析配基的選擇親和層析配基的選擇Selection of ligand）1.純化對象和配基之

18、間必須有較強的親和力。純化對象和配基之間必須有較強的親和力。2.但親和力太高也是有害的，因為在解離配但親和力太高也是有害的，因為在解離配 基復合物時所基復合物時所 需的條件就要強烈，這樣可能需的條件就要強烈，這樣可能使生物分子變性。使生物分子變性。3.配基必須具有適當?shù)幕瘜W基團，可用于和配基必須具有適當?shù)幕瘜W基團，可用于和載體相連，同時又不影響配基與生物分子載體相連，同時又不影響配基與生物分子之間的親和力。之間的親和力。8載體、配基、目的物的連接載體、配基、目的物的連接（Conjunction of vector、ligand and target material）載體載體Vectors o

19、r Matrix） +配基配基Ligand） +目的物目的物target material）Fig AC relies upon a reversible highly specific binding reaction.Fig Spacer arm principle A spacer is sometimes used to ensure full accessibility of the affinity ligand.Fig Principle of preparing AC media9 9親和層析的基本操作方法：親和層析的基本操作方法：n平衡（平衡（ Equilibration）n

20、 用平衡用平衡Buffer沖洗柱體，至基沖洗柱體，至基線平穩(wěn)線平穩(wěn).樣品上柱和沖洗樣品上柱和沖洗（Sample application and wash） 樣品中的目的物與層析介質(zhì)選擇樣品中的目的物與層析介質(zhì)選擇性的吸附，雜質(zhì)不被吸附。用上樣性的吸附，雜質(zhì)不被吸附。用上樣Buffer沖洗柱體，雜質(zhì)被沖洗下來。沖洗柱體，雜質(zhì)被沖洗下來。形成雜質(zhì)峰見下圖）。形成雜質(zhì)峰見下圖）。洗脫洗脫Elution） 選擇適當?shù)臈l件，將吸附在親和介質(zhì)上的目選擇適當?shù)臈l件，將吸附在親和介質(zhì)上的目的物解吸下來見下圖）。的物解吸下來見下圖）。四、核酸類制品的分離純化方法四、核酸類制品的分離純化方法（Isolation

21、and depuration of Isolation and depuration of nucleic acid nucleic acid ）核酸類藥物生產(chǎn)方法主要有提取法和發(fā)核酸類藥物生產(chǎn)方法主要有提取法和發(fā)酵法。提取法生產(chǎn)酵法。提取法生產(chǎn)DNADNA和和RNARNA，先提取核，先提取核酸和蛋白質(zhì)復合物，再解離核酸與蛋白酸和蛋白質(zhì)復合物，再解離核酸與蛋白質(zhì)，然后分離質(zhì)，然后分離RNARNA與與DNADNA。發(fā)酵法主要用。發(fā)酵法主要用于生產(chǎn)單核苷酸。于生產(chǎn)單核苷酸。高RNA含量酵母搖瓶發(fā)酵種子培養(yǎng)物連續(xù)發(fā)酵發(fā)酵液過濾酵母菌體NaOH20攪拌破壁氨水處理離心上清液沉淀蛋白三氯乙酸酸調(diào)pH核酸

22、粗品乙醇洗滌枯燥RNA干品五、糖類制品的分離純化方法五、糖類制品的分離純化方法（ Isolation and depuration of Isolation and depuration of sugar sugar ） 由于各種糖類制品的性質(zhì)由于各種糖類制品的性質(zhì)和原料來源不同，沒有統(tǒng)一規(guī)范的和原料來源不同，沒有統(tǒng)一規(guī)范的提取和純化工藝。這里只介紹多糖提取和純化工藝。這里只介紹多糖和粘多糖的一般分離純化方法。和粘多糖的一般分離純化方法。 （1提取方法提取方法 （extraction） 非降解法適用于從含一種粘多糖的非降解法適用于從含一種粘多糖的動物組織中提取粘多糖，提取采用的溶動物組織中提取

23、粘多糖，提取采用的溶劑是水或鹽溶液。劑是水或鹽溶液。 降解法降解法degradation適用于從組適用于從組織中提取結(jié)合比較牢固的粘多糖織中提取結(jié)合比較牢固的粘多糖mucoitin）。如從軟骨中分離提取硫酸）。如從軟骨中分離提取硫酸軟骨素軟骨素chondroitin sulfate），就是），就是用堿處理進行降解。又如用酶處理法可用堿處理進行降解。又如用酶處理法可提取與蛋白質(zhì)結(jié)合的多糖。提取與蛋白質(zhì)結(jié)合的多糖。 （2分離方法 （isolation） 常用的分離方法是沉淀法和離子交換層析法。乙醇沉淀法alcohol precipitation）：是從提取液中沉淀多糖的最簡易方法，也適用于分級分離

24、。4-5倍體積的乙醇可以使任何結(jié)締組織中的粘多糖完全沉淀。用季銨化合物也可沉淀粘多糖。粘多糖的聚陰離子能與某些陽離子表面活性劑結(jié)合成不溶于水的鹽，如十六烷基三甲基銨CTA等。 離子交換層析法ion exchange chromatagraphy)：粘多糖的聚陰離子能夠很好地被陰離子交換劑吸附和分離，如Dowex I-X2商品名離子交換樹脂、DEAE-離子交換纖維素二乙胺乙基等。洗脫可用NaC1溶液進行梯度洗脫。六、脂類制品的分離純化方法六、脂類制品的分離純化方法 （isolation and depuration of lipoidisolation and depuration of lip

25、oid）（1 1提取方法提取方法extraction extraction ） 脂類自然狀態(tài)下是以結(jié)合形式存在的。脂類自然狀態(tài)下是以結(jié)合形式存在的。非極性脂是與其他脂質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子非極性脂是與其他脂質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)相結(jié)合的。提取脂質(zhì)就是要選擇的疏水區(qū)相結(jié)合的。提取脂質(zhì)就是要選擇適當?shù)娜軇﹣砥茐倪@種結(jié)合鍵，將脂質(zhì)溶適當?shù)娜軇﹣砥茐倪@種結(jié)合鍵，將脂質(zhì)溶解出來。常用的溶劑有組合溶劑，醇是其解出來。常用的溶劑有組合溶劑，醇是其中的主要成分，此外還有氯仿、甲醇、水中的主要成分，此外還有氯仿、甲醇、水等。等。 （2純化方法純化方法depuration） 沉淀法沉淀法(precipitatio

26、n) ：由于不同脂質(zhì)在丙酮：由于不同脂質(zhì)在丙酮中溶解度不同，故常用它進行沉淀。中溶解度不同，故常用它進行沉淀。吸附層析法吸附層析法(adsorption chromatography)：常：常用吸附劑有硅膠、氧化鋁等。它是通過極性用吸附劑有硅膠、氧化鋁等。它是通過極性和離子力等把各種化合物結(jié)合到固體吸附劑和離子力等把各種化合物結(jié)合到固體吸附劑上。洗脫一般是采用極性逐漸增大的洗脫液上。洗脫一般是采用極性逐漸增大的洗脫液來進行，非極性的先流出，極性的后流出。來進行，非極性的先流出，極性的后流出。 離子交換層析法離子交換層析法Ion exchange Ion exchange chromatogra

27、phychromatography） : : 脂質(zhì)分子的存在有脂質(zhì)分子的存在有非解離、兩性離子和酸式解離三種狀態(tài)。非解離、兩性離子和酸式解離三種狀態(tài)。根據(jù)它們在一定根據(jù)它們在一定pHpH條件下的解離情況，選條件下的解離情況，選擇適當?shù)碾x子交換劑可將它們提純。如擇適當?shù)碾x子交換劑可將它們提純。如TEAETEAE纖維素對分離脂肪酸和膽汁酸等特纖維素對分離脂肪酸和膽汁酸等特別有效。別有效。 七、氨基酸類制品的分離純化方法七、氨基酸類制品的分離純化方法 （isolation and depuration of Aa）（1氨基酸的生產(chǎn)方法氨基酸的生產(chǎn)方法production of Aa）蛋白質(zhì)水解法蛋白

28、質(zhì)水解法protein hydrolysis）：水）：水解法有酸水解解法有酸水解acid hydrolysis）、堿水）、堿水解解base hydrolysis和酶水解和酶水解enzyme hydrolysis三種。三種。 用鹽酸水解為常用方法，其優(yōu)點是水解迅速、完全，產(chǎn)物全部是L型氨基酸，缺點是色氨酸全部被破壞，絲氨酸等部分被破壞。堿水解法易產(chǎn)生消旋作用，較少應用。酶水解法水解不夠完全。 發(fā)酵法發(fā)酵法fermentation）：）：菌株經(jīng)過發(fā)酵后，從培養(yǎng)液中提純氨菌株經(jīng)過發(fā)酵后，從培養(yǎng)液中提純氨基酸?；?。 化學合成與酶促合成法化學合成與酶促合成法化學合成法一般得到的是化學合成法一般得到的是

29、DL型氨基型氨基酸，尚需要對異構(gòu)體拆分；酶促合成法酸，尚需要對異構(gòu)體拆分；酶促合成法也是酶工程在醫(yī)藥工業(yè)上的應用，優(yōu)點也是酶工程在醫(yī)藥工業(yè)上的應用，優(yōu)點是技術(shù)工藝簡單，轉(zhuǎn)化率高，副產(chǎn)物少是技術(shù)工藝簡單，轉(zhuǎn)化率高，副產(chǎn)物少和易提純等。和易提純等。（2氨基酸的分離方法氨基酸的分離方法isolation of Aa） 有沉淀法有沉淀法percipitation）、吸附法）、吸附法adsorption和離子交換法和離子交換法ion-exchange ) 。沉淀法沉淀法(percipitation)：根據(jù)形成沉淀的原理：根據(jù)形成沉淀的原理不同分為兩種：不同分為兩種：是依據(jù)不同氨基酸在水中是依據(jù)不同氨基酸

30、在水中或其他溶劑中的溶解度差異進行沉淀分離?；蚱渌軇┲械娜芙舛炔町愡M行沉淀分離。是用特殊試劑沉淀某種氨基酸，如用鄰二是用特殊試劑沉淀某種氨基酸，如用鄰二甲苯甲苯-4-磺酸與亮氨酸形成不溶性鹽沉淀，再磺酸與亮氨酸形成不溶性鹽沉淀，再用氨水分解，使亮氨酸游離出來。用氨水分解，使亮氨酸游離出來。 吸附法(adsorption)：這是利用吸附劑根據(jù)氨基酸吸附力的差異進行氨基酸分離的方法。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分離就是利用活性炭對其吸附的原理。 離子交換法ion-exchange )：氨基酸是兩性電解質(zhì)，在一定pH條件下，不同氨基酸帶電性質(zhì)及解離狀態(tài)是不相同的，因此在離子交換劑上被吸附的強度不同。

31、常用的離子交換劑為強酸型陽離子交換樹脂，洗脫主要用pH梯度洗脫。 第二節(jié)第二節(jié) 人體來源生物制品制備實例人體來源生物制品制備實例 （Example of bio-preparation Example of bio-preparation application to humanapplication to human）一、人血漿白蛋白制劑的制備一、人血漿白蛋白制劑的制備preparation of human blood plasma preparation of human blood plasma albuminalbumin）（1 1結(jié)構(gòu)和性質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì) （structure and

32、structure and charactercharacter）人血是一種紅色混濁的、具有一定腥味與人血是一種紅色混濁的、具有一定腥味與粘滯性的液體。用適當?shù)目鼓齽┏テ渲姓硿缘囊后w。用適當?shù)目鼓齽┏テ渲械挠行纬煞秩缂t血球而得到淡黃色、的有形成分如紅血球而得到淡黃色、半透明的液體叫血漿。半透明的液體叫血漿。血漿中除含有大量的水分以外，還含有血漿血漿中除含有大量的水分以外，還含有血漿蛋白等溶質(zhì)。蛋白等溶質(zhì)。白蛋白白蛋白albumin又稱清蛋白，白蛋白是又稱清蛋白，白蛋白是血漿蛋白中含量最高血漿蛋白中含量最高3.84.8%）、分子量）、分子量最小、分子數(shù)最多的一類蛋白質(zhì)。最小、分子數(shù)最多的一

33、類蛋白質(zhì)。白蛋白對治療因失血、創(chuàng)傷、燒傷等引起的白蛋白對治療因失血、創(chuàng)傷、燒傷等引起的休克，腦水腫和大腦損傷性所致的腦壓增高，休克，腦水腫和大腦損傷性所致的腦壓增高，防止低蛋白血癥，肝硬化或者由腎病引起的水防止低蛋白血癥，肝硬化或者由腎病引起的水腫與腹水等嚴重疾病具有良好療效。腫與腹水等嚴重疾病具有良好療效。白蛋白為單鏈分子，由白蛋白為單鏈分子，由584個氨基酸殘基個氨基酸殘基組成，組成，N端為天門冬氨酸，端為天門冬氨酸，C端為亮氨酸，端為亮氨酸，分子量為分子量為6.6104，在離子強度為，在離子強度為0.15時，時，pI為為4.7，易溶于水，在，易溶于水，在60%硫酸銨飽和度硫酸銨飽和度以上

34、沉淀。對酸較穩(wěn)定，受熱變性。以上沉淀。對酸較穩(wěn)定，受熱變性。從人體中分離的白蛋白有兩種：一種是從人體中分離的白蛋白有兩種：一種是從健康人血漿中分離制得的人血清白蛋白，從健康人血漿中分離制得的人血清白蛋白，另一種是從健康產(chǎn)婦胎盤中分離制得的胎另一種是從健康產(chǎn)婦胎盤中分離制得的胎盤白蛋白。盤白蛋白。 血無抗凝劑）血無抗凝劑）自然凝固自然凝固分離出血清無纖維蛋白酶原、凝血因子等）分離出血清無纖維蛋白酶原、凝血因子等）血血+混合抗凝劑混合抗凝劑 草酸銨草酸銨草酸鉀草酸鉀離離 心心上清血漿上清血漿總蛋白：總蛋白：6.2-7.9%白蛋白：白蛋白：3.8-4.8%水：水：90-92%（現(xiàn)常用肝素、檸檬酸鈉）

35、（現(xiàn)常用肝素、檸檬酸鈉）（2 2工藝路線工藝路線 利凡諾利凡諾,NaHCO3pH8.6,離心分離離心分離絡合物蒸餾水，蒸餾水，NaCl，HCl弱酸性，弱酸性，40，離心，離心離心液濃濃 縮縮超超 濾濾濃縮液滅活病毒滅活病毒 65，1h；60，10h熱處理液除菌除菌過濾白蛋白液枯燥冷凍干燥白蛋白去雜蛋白人血漿（人血漿（% %）男性尿男性尿 沉淀沉淀1010下，下，pH8.5pH8.5上清尿液上清尿液酸酸 化化 pH5.0-5.5pH5.0-5.5酸化尿酸化尿吸吸 附附硅藻土，硅藻土，55硅藻土吸附物硅藻土吸附物洗滌洗滌5，水，水硅藻土硅藻土柱柱洗脫洗脫0.02%氨水，氨水，0.1mol/L Na

36、Cl洗脫液洗脫液去熱源、色素去熱源、色素DEAE-SephadexA50柱，柱，pH8.0,（二乙氨乙基葡聚糖）（二乙氨乙基葡聚糖）流出液流出液（活性（活性部分）部分）濃濃 縮縮羧甲基纖維素羧甲基纖維素CMCCMC柱，柱，pH4.2)pH4.2)CMCCMC柱柱洗脫洗脫HAC-NaAC)NH3+NaCl,pH11.5-11.8洗脫液洗脫液透透 析析H2O,4透析液透析液凍凍 干干廢品廢品孕婦尿粗制粗制尿：苯甲酸：乙醇尿：苯甲酸：乙醇/1：0.075：5）用用HCl調(diào)調(diào)pH 4-5HCG(粗品）提取提取NaAC pH4.8提取液透析透析水，水，5以下以下透析內(nèi)液吸附吸附CM SepharoseC

37、I-6B）羧甲基瓊脂糖凝膠羧甲基瓊脂糖凝膠吸附后交換劑洗滌洗滌，峰峰NaAC,pH4.8,pH5.9洗滌后交換劑洗脫洗脫NaAC,pH8.5洗脫液冷凍干燥冷凍干燥 30HCG精品 溶解溶解蒸餾水，蒸餾水，10以下以下HCG溶液透析透析pH6.8, 5以下以下透析內(nèi)液吸附吸附羥基磷灰石，羥基磷灰石，pH6.8吸附物解吸解吸0.5mmol/L,1.0mmol/L磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液PBS),pH6.8解吸液枯燥枯燥30HCG純品三、絨膜促性激素三、絨膜促性激素HCG,懷孕懷孕4570天含量高的制天含量高的制備備治療女性不育癥，神經(jīng)性皮炎治療女性不育癥，神經(jīng)性皮炎,子宮出血和習慣性流產(chǎn)子宮出血和

38、習慣性流產(chǎn)四、人體來源藥物的研究前景四、人體來源藥物的研究前景 （prospect）人體來源的原料雖只限于血液、胎盤、尿液人體來源的原料雖只限于血液、胎盤、尿液、毛發(fā)等有限幾種，但利用前景很廣闊。、毛發(fā)等有限幾種，但利用前景很廣闊。1、可進一步開發(fā)新產(chǎn)品、可進一步開發(fā)新產(chǎn)品 exploitation of new productio）（1血液的利用，血漿蛋白可分離為血液的利用，血漿蛋白可分離為I-V5個個成分。目前僅利用了其中的成分。目前僅利用了其中的I纖維蛋白原）纖維蛋白原）、II免疫球蛋白和免疫球蛋白和V白蛋白白蛋白3個組分個組分，III和和IV，目前基本未加以利用。，目前基本未加以利用。

39、（2 2對其他原料的利用，胎盤是重要的人類對其他原料的利用，胎盤是重要的人類原料之一，較好利用的只有胎盤球蛋白原料之一，較好利用的只有胎盤球蛋白、胎盤白蛋白等少數(shù)品種。、胎盤白蛋白等少數(shù)品種。 一、動物來源生物制品制備的實例一、動物來源生物制品制備的實例1 1、胰島素的制備、胰島素的制備 （production of production of insulininsulin）（1 1胰島素的性質(zhì)：胰島素的性質(zhì)：pI=5.3-5.4pI=5.3-5.4，由，由A A鏈鏈、B B鏈通過兩個二硫鍵連接；鏈通過兩個二硫鍵連接；A A鏈含鏈含2121個氨個氨基酸，基酸，B B鏈含鏈含3030個氨基酸；是

40、所有蛋白質(zhì)中個氨基酸；是所有蛋白質(zhì)中研究得最多，也是研究得最清楚的蛋白。研究得最多，也是研究得最清楚的蛋白。 第三節(jié)第三節(jié) 動物來源生物制品的制備動物來源生物制品的制備（2 2工藝路線工藝路線豬胰臟提取提取乙醇，草酸，乙醇，草酸，10-15提取液堿化堿化氨水，氨水，pH8-8.4堿化液酸化酸化硫酸，硫酸，pH3.6-3.8,5 酸化液濃縮濃縮30 以下，減壓以下，減壓濃縮液去脂去脂速熱速冷速熱速冷去脂溶液鹽析鹽析NaCl,pH2-2.5鹽析物水、丙酮、氨水水、丙酮、氨水pH4.24.3）除酸性蛋白除酸性蛋白濾液鋅沉淀鋅沉淀氨水，氨水，ZnAc2，pH6.0沉淀除堿性蛋白，結(jié)晶除堿性蛋白，結(jié)晶Z

41、nAc2，丙酮、氨水，丙酮、氨水，pH8.0，5以下，檸檬酸調(diào)以下，檸檬酸調(diào)pH6.0結(jié)晶結(jié)晶洗滌，枯燥洗滌，枯燥水、丙酮、乙醚水、丙酮、乙醚胰島素精品胰島素精品2 2、超氧化物歧化酶、超氧化物歧化酶SODSOD的制備的制備超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶superoxide dismutase, superoxide dismutase, SODSOD與機體抗衰老、腫瘤發(fā)生、自身免疫疾與機體抗衰老、腫瘤發(fā)生、自身免疫疾病和輻射防護等有關(guān)。用于炎癥、類風濕性關(guān)病和輻射防護等有關(guān)。用于炎癥、類風濕性關(guān)節(jié)炎、慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎及放射治療后的炎癥節(jié)炎、慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎及放射治療后的炎癥等。等。SODSOD

42、存在于動物、植物、微生物中，有存在于動物、植物、微生物中，有Cu-Zn-Cu-Zn-SODSOD、Mn-SODMn-SOD、Fe-SODFe-SOD等。等。牛紅細胞牛紅細胞SODSOD為為Cu-Zn-SODCu-Zn-SOD，由兩個亞基組成，由兩個亞基組成，每個亞基含，每個亞基含1 1個個CuCu和和1 1個個ZnZn。在。在pH7.6-9.0pH7.6-9.0時時穩(wěn)定。它催化超氧負離子歧化為穩(wěn)定。它催化超氧負離子歧化為H2O2H2O2。 新鮮豬血新鮮豬血去血漿，離心去血漿，離心紅細胞紅細胞0.9%NaCl,反復洗滌反復洗滌3次次搜集搜集工藝路線工藝路線浮洗浮洗凈紅細胞凈紅細胞溶血溶血血去離子

43、水，血去離子水，5,30min溶血物溶血物去血紅蛋白去血紅蛋白乙醇，氯仿乙醇，氯仿,15min上清液上清液沉淀沉淀丙酮，丙酮，0沉淀物沉淀物去離子水去離子水55-65，10-15min黃綠色澄清液黃綠色澄清液沉去不溶蛋白，透析沉去不溶蛋白，透析丙酮，去離子水，丙酮，去離子水，0，6-8h透析液透析液吸附、吸脫、超濾、濃縮、枯燥吸附、吸脫、超濾、濃縮、枯燥DEAE-SephadexA50,磷酸緩沖液磷酸緩沖液K3PO4），），pH7.6SOD成品成品第四節(jié)第四節(jié) 基因工程生物制品的制備基因工程生物制品的制備 先確定與某種疾病有關(guān)的具有預防或治療作用的蛋先確定與某種疾病有關(guān)的具有預防或治療作用的蛋

44、白質(zhì)，然后將控制該蛋白合成的基因分離或進行人工合白質(zhì)，然后將控制該蛋白合成的基因分離或進行人工合成，利用重組成，利用重組DNA技術(shù)將該基因加以改造，再將改造后技術(shù)將該基因加以改造，再將改造后的基因?qū)肟梢圆粩喾敝车氖荏w細胞，從而大規(guī)模生產(chǎn)的基因?qū)肟梢圆粩喾敝车氖荏w細胞，從而大規(guī)模生產(chǎn)具有預防和治療這種疾病的蛋白質(zhì)。通過這種方法生產(chǎn)具有預防和治療這種疾病的蛋白質(zhì)。通過這種方法生產(chǎn)的新型生物制品稱為基因工程生物制品。的新型生物制品稱為基因工程生物制品。上游技術(shù)：工程菌的構(gòu)建上游技術(shù)：工程菌的構(gòu)建下游技術(shù)：目的基因產(chǎn)物的分離純化下游技術(shù)：目的基因產(chǎn)物的分離純化一、上游技術(shù)：工程菌的構(gòu)建一、上游技術(shù)

45、：工程菌的構(gòu)建1、目的基因的分離制備與鑒定、目的基因的分離制備與鑒定2、重組載體的選擇與制備、重組載體的選擇與制備3、目的基因與載體的重組、目的基因與載體的重組4、構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)染適當?shù)氖荏w細胞表達載體）、構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)染適當?shù)氖荏w細胞表達載體）5、篩選含有重組子的細胞進行擴增、篩選含有重組子的細胞進行擴增1、目的基因的分離制備與鑒定、目的基因的分離制備與鑒定（1目的基因所處染色體的確定目的基因所處染色體的確定（2目的基因的獲取目的基因的獲取 目的基因可以是染色體目的基因可以是染色體DNA、cDNA或人工合成的或人工合成的DNA，目的基因不同，獲取方法也不同。目的基因不同，獲取方法也不同。

46、A、限制性內(nèi)切酶切取目的基因、限制性內(nèi)切酶切取目的基因B、用逆轉(zhuǎn)錄酶制備、用逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA又稱又稱cDNA法）法）C、化學合成目的基因、化學合成目的基因 用來分離原核基因的方法。獲取的基因是染色體用來分離原核基因的方法。獲取的基因是染色體DNA。 破碎細胞破碎細胞分離染色體分離染色體限制性內(nèi)切酶作用限制性內(nèi)切酶作用目的基因目的基因限制性內(nèi)切酶切取目的基因限制性內(nèi)切酶切取目的基因 用來分離真核基因的方法。以目的基因的用來分離真核基因的方法。以目的基因的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補DNAcDAN）。）。用逆轉(zhuǎn)錄酶制備用逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA又稱又稱cDNA法）法）化學合

47、成目的基因化學合成目的基因 利用磷酸二酯法、磷酸三酯法等方法合成?；瘜W合成的先決條件是必須要知道DNA的堿基順序。此法一般只能合成較短的多肽激素基因。世界上第一個人工化學合成并表達的基因是生長素釋放抑制素基因。 在獲取目的基因后，應首先考慮所得基因是否在獲取目的基因后，應首先考慮所得基因是否是所需要的目的基因。是所需要的目的基因。凝膠電泳及酶切圖譜測定凝膠電泳及酶切圖譜測定核酸雜交核酸雜交DNA序列測定序列測定（3目的基因的鑒定目的基因的鑒定常用的載體有：細菌質(zhì)粒常用的載體有：細菌質(zhì)粒 質(zhì)粒是一些細菌的亞細胞結(jié)構(gòu)，是存在于多種細菌染色體外的遺傳單位。質(zhì)粒是一些細菌的亞細胞結(jié)構(gòu)，是存在于多種細菌

48、染色體外的遺傳單位。是一類雙鏈、閉環(huán)的是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，分子量約分子，分子量約1-200kb。質(zhì)粒。質(zhì)粒DNA分子可以游離存分子可以游離存在于染色體外，在一定條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的在于染色體外，在一定條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂遺傳給后代。作為載體，質(zhì)?？梢越蛹{中等大小復制而復制，并通過細胞分裂遺傳給后代。作為載體，質(zhì)?？梢越蛹{中等大小的的DNA片斷，如小于片斷，如小于10kb的的DNA；如果大于；如果大于10kb的的DNA插入質(zhì)粒，將大大降插入質(zhì)粒，將大大降低重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量。低重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量。

49、2、重組載體的選擇與制備、重組載體的選擇與制備 pBR322 pBR322質(zhì)粒來源：質(zhì)粒來源：pSF2124pSF2124質(zhì)粒的氨卞青霉素抗性基因質(zhì)粒的氨卞青霉素抗性基因AprApr）；）；pSC101pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因TcrTcr）；）；ColEColE的派的派生質(zhì)粒的復制起點生質(zhì)粒的復制起點oriori）。在）。在AprApr基因中有一個基因中有一個PstPst切點，切點， TcrTcr基因中有一個基因中有一個BamHBamH和一個和一個SalSal切點。切點。pBR322AprTcrOriPstBamHSal 用限制性內(nèi)切酶和連接酶將所需目的基因插入用限制性內(nèi)切酶和連接酶將所需目的基因插入選定的載體中。選定