藥五倍子化學(xué)成分對早期齲再礦化作用的掃描電鏡觀察

1、藥五倍子化學(xué)成分對早期齲再礦化作用的掃描電鏡觀察    【摘要】     目的觀察pH循環(huán)后中藥五倍子化學(xué)成分對早期齲表面形態(tài)變化的影響，了解中藥五倍子化學(xué)成分對人工早期釉質(zhì)齲的再礦化作用。方法應(yīng)用離體牛切牙制備人工釉質(zhì)齲標本60例,隨機分為6組：NaF組（陽性對照）、GCE組、GCE-B組、GCE-B1組、GCE-B2組和去離子水組（陰性對照），進行體外pH循環(huán)實驗后，各組樣本分別放入2.5%戊二醛液內(nèi)固定24 h，4，臨界點干燥，鍍金，掃描電鏡下觀察。結(jié)果再礦化后，NaF組的釉質(zhì)表面變的比礦化前更加規(guī)

2、則、均勻的外觀，有許多圓形或橢圓形的晶體顆粒沉積，大顆粒常由數(shù)個小顆粒組成，密集、緊奏，略顯隆起。GCE組、GCE-B組、GCE-B1組的釉質(zhì)表面有一層似膜狀的結(jié)構(gòu)形成，有一定厚度,進一步觀察這層膜結(jié)構(gòu)是由一些呈小球狀或不規(guī)則的顆粒組成,但外觀顯得相對不如氟化物組那樣規(guī)則、均勻。而GCE-B2組釉質(zhì)表面沒有明顯的沉積物形成，其外觀與去離子水組相似，可見釉柱中心發(fā)生脫礦所形成的凹坑。結(jié)論五倍子化學(xué)成分GCE、GCE-B和GCE-B1具有潛在的促進早期齲再礦化的功效。     【關(guān)鍵詞】  五倍子 有效成分 早期齲 再礦化 掃描電鏡 &#

3、160;  Effect of Chemical Compounds of Galla chinensis on Remineralisation of Initial Enamel Carious Lesions by SEM in vitroCHU Jinpu, HAO Yuqing， LI Jiyao, ZHOU Xuedong 1.Department of Cardiology and Endodontology, Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China; 2. Key Laboratory of Oral

4、 Biomedical Engineering of Ministry of Education , Sichuan University , Chengdu 610041 ,ChinaAbstract：ObjectiveTo evaluate the effect of chemical compounds of Galla Chinensis on the remineralisation of initial enamel carious lesions by scanning electron microscope in vitro. MethodsSixty bovine ename

5、l blocks with early lesions were prepared and randomly divided into six treatment groups.The lesions were subjected to the pH-cycling regime for 12 days. Each daily cycle included 4 x 1 min applications with one of six treatments;1,000ppm F aq. (as NaF, positive control); deionized water (negative c

6、ontrol); or 4,000 ppm aqueous solutions of four Galla Chinensis extracts (GCEs); GCE, GCE-B, GCE-B1, or GCE-B2. After pH-cycling,the enamel specimens were observed by scanning electron microscope.ResultsThe results showed that there were sediments formed on the surface of carious lesion for the posi

7、tive control, GCE, GCE-B and GCE-B1 groups except the GCE-B2 group and DDW group. ConclusionGalla Chinensis might be a promising source of non-fluoride anti-caries agents.Key words：Galla Chinensis;  Active ingredients;  Initial enamel lesions;  Remineralization;  SEM  &

8、#160; 齲病是發(fā)生在牙齒硬組織的一種慢性細菌性疾病，發(fā)病率高，分布廣，嚴重影響人類口腔及全身健康。含氟制劑的使用是目前齲病預(yù)防最常用的方法，但氟制劑的使用具有明顯的局限性，如氟斑牙、氟骨癥等。因此，尋找新的安全、有效的防齲藥物越來越受到齲病防治領(lǐng)域?qū)W者們的重視。 近年來中藥在齲病防治方面的研究備受關(guān)注。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥五倍子對口腔中與齲病發(fā)生關(guān)系密切的細菌有明顯的抑制作用1，2，尤其五倍子還能促進早期釉質(zhì)齲的再礦化 35。本實驗?zāi)康氖抢脪呙桦婄R(SEM) 觀察五倍子處理早期釉質(zhì)齲后的超微結(jié)構(gòu)，進一步闡明五倍子促進早期釉質(zhì)齲再礦化的作用機制，為五倍子防齲的推廣應(yīng)用奠定基

9、礎(chǔ)。1  材料五倍子為四川產(chǎn)五倍子Rhus chinesis Mill，由四川省天然藥物研究重點實驗室提供。其化學(xué)組分提取方法為：1 000 g五倍子粉碎，以3 000 ml去離子水于6070水浴10 h，振搖，過濾，濾渣，重復(fù)上次操作，合并濾液，加活性炭脫色，過濾，濾液濃縮至稠膏狀，加95%乙醇，攪拌溶解，過濾，乙醇液減壓濃縮得類白色粉末狀物約160 g，為五倍子多酚性化合物總鞣質(zhì)(Galla Chinensis extract , GCE)。取GCE 15 g，以葡聚糖凝膠sephadex LH-20為分離材料進行梯度洗脫，葡聚糖凝膠sephadex LH-20 200克裝柱，樣

10、品以水溶解上樣，經(jīng)30%乙醇1 500 ml洗脫，減壓濃縮至干，得GCE-B 2.7 g。將GCE-B（30%乙醇組分）取2 g樣品以水溶解上樣，洗脫液甲醇水（28-37-46），收集，每份30ml,濃縮至干得白色粉末狀物GCE-B1和GCE-B2。經(jīng)核磁共振氫譜（1H-NMR）、核磁共振碳譜（13C-NMR）的結(jié)構(gòu)鑒定GCE-B1為沒食子酸（Gallic acid），GCE-B2為沒食子酸甲酯（Methyl Gallate）。2 方法2.1 釉質(zhì)的預(yù)備選擇新鮮拔除的牛切牙,除去表面有機污染物，分離冠根, 冠部超聲清洗，干燥，體視顯微鏡下觀察無齲損、氟斑、裂痕。用硬組織切割機將牙冠切成5 mm

11、×5 mm×2 mm大小的釉質(zhì)塊，唇面釉質(zhì)用拋光機及碳化硅砂紙（800#1200#2400#）在流水下依次磨平、拋光。選擇釉質(zhì)塊60個，超聲清洗，自然干燥，釉質(zhì)塊表面開窗4 mm×4 mm大小 ,其余部位涂布兩層抗酸指甲油。2.2  人工齲實驗將預(yù)備好的釉質(zhì)標本用嵌體蠟固定在自制的環(huán)形玻棒上，放入盛有脫礦溶液2.2 mmol/L Ca(NO3)2，2.2 mmol/L KH2PO4、50 mmol/L醋酸，1.0 mmol/L NaN3，0.1mg/L NaF，用5 mol/L的KOH調(diào)至pH為4.5的玻璃器皿中，釉質(zhì)表面與溶液的比率為20 mm2/10

12、 ml，磁攪拌儀攪拌（100 r/min），37脫礦3 d。2.3 再礦化實驗60個人工釉質(zhì)齲樣本隨即分為6組（10個/組），即：NaF組(陽性對照)、 GCE組、 GCE-B組、GCE-B1組、GCE-B2組，去離子水組(陰性對照)。各實驗組藥物濃度都為4g/L，用2 mol/L NaOH將pH調(diào)至7.0。然后各組分別進行pH循環(huán)實驗，共循環(huán)12 d，其每天的具體方案5見表1。表1  再礦化pH循環(huán)實驗方案（略）2.4 掃描電鏡觀察pH循環(huán)后，各組樣本分別放入2.5%戊二醛液內(nèi)固定24 h、4，臨界點干燥，鍍金，掃描電鏡下觀察，工作電壓為20KV。3 結(jié)果在掃描電鏡下觀察,再礦化后

13、，氟化物組的釉質(zhì)表面變的比礦化前更加規(guī)則、均勻的外觀，有許多圓形或橢圓形的晶體顆粒沉積，大顆粒常由數(shù)個小顆粒組成，密集、緊奏，略顯隆起（圖1）。GCE組、GCE-B組、GCE-B1組的釉質(zhì)表面有一層似膜狀的結(jié)構(gòu)形成，有一定厚度,進一步觀察這層膜結(jié)構(gòu)是由一些呈小球狀或不規(guī)則的顆粒組成, 其中GCE組相對較厚較多，GCE-B組、GCE-B1組分別次之，但外觀顯得相對不如氟化物組那樣規(guī)則、均勻（圖24）。GCE-B2組釉質(zhì)表面沒有明顯的沉積物形成，其外觀與去離子水組相似，可見釉柱中心發(fā)生脫礦所形成的凹坑（圖56）。4 討論    五倍子是近年來研究較多的防齲中藥之一，本

14、實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)五倍子對牙齒硬組織再礦化具有一定的作用35。本實驗采用體外化學(xué)模型pH循環(huán)、通過掃描電鏡(SEM)對其化學(xué)成分處理早期釉質(zhì)齲后的超微結(jié)構(gòu)變化進行了進一步觀察。再礦化是鈣、磷和其他礦物離子沉積于正常或部分脫礦的牙釉質(zhì)內(nèi)或釉質(zhì)表面的過程。掃描電鏡觀察結(jié)果證實，經(jīng)再礦化pH循環(huán)后，五倍子GCE組、GCE-B組、GCE-B1組釉質(zhì)樣本表面都有一層似膜狀的結(jié)構(gòu)沉積,這層膜結(jié)構(gòu)是由一些呈小球狀或不規(guī)則的顆粒組成,表明其表面發(fā)生了礦物質(zhì)的沉積，但與陽性對照組（NaF組）比則有明顯不同，氟化物組釉質(zhì)表面有許多圓形或橢圓形的晶體顆粒沉積，比較規(guī)則、均勻，說明五倍子與氟化物的再礦化機制可能不同。

15、而GCE-B2組釉質(zhì)樣本表面沒有明顯的沉積物形成，可見釉柱中心發(fā)生脫礦所形成的凹坑，其外觀與陰性對照組（DDW組）相似，這證明GCE-B2沒有促進早期釉質(zhì)齲的再礦化。再礦化是部分溶解的晶體被來源于溶液中的鈣磷離子沉積誘導(dǎo)而增長的過程6。五倍子中的主要成分為鞣質(zhì)及沒食子酸。研究證明，鞣酸能與細胞外或組織外的鈣離子的絡(luò)合，形成難溶性的絡(luò)合物，食物中的鞣酸能影響人體對鈣離子的吸收7。本實驗通過使用Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠從五倍子鞣質(zhì)GCE中分離得到3個組分： GCE-B、GCE-B1和GCE-B2。經(jīng)鑒定，GCE-B為GCE去除酚酸聚合體后的小分子多酚性化合物，GCE-B1為沒食子酸

16、，GCE-B2為沒食子酸甲酯。結(jié)果表明， GCE、GCE-B、GCE-B1對早期釉質(zhì)齲均具有再礦化作用，其再礦化主要發(fā)生在表層和表層下，五倍子再礦化的作用機制可能是鞣酸與溶液中的鈣離子發(fā)生反應(yīng)形成絡(luò)合物，通過釉質(zhì)表面微孔道滲透進齲損內(nèi)部，促進鈣離子沉積，從而引導(dǎo)部分溶解晶體增長促進了再礦化。    通過掃描電鏡(SEM)形態(tài)學(xué)研究再次證明五倍子GCE組、GCE-B組、GCE-B1能促進早期釉質(zhì)齲的再礦化，其結(jié)果與我們以前的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果從形態(tài)學(xué)角度進一步闡明了五倍子促進早期釉質(zhì)齲再礦化的作用機制，為五倍子防齲的推廣應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。 

17、0;  【參考文獻】  1黃正蔚,周學(xué)東,李繼遙，等.中藥影響變形鏈球菌對唾液獲得性膜黏附的研究J. 四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2003，34(1): 135.2謝倩，李繼遙，左渝陵，等.天然藥物五倍子提取物對致齲菌生長的影響J.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，23（1）：82.3楚金普，李繼遙，郝玉慶，等.中藥五倍子化學(xué)成分對早期齲表面顯微硬度的影響J.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2006，41(10): 616.4Chu JP, Li JY, Hao YQ, et al. Effect of compounds of Galla chinensis on remineralisation of initial enamel carious le