魚(yú)腥草指紋圖譜研究及其中黃酮類成分分離制備

1、 回流提取三次,合并提取液堿壓濃縮得膏狀物,將膏狀物以1g:2mL的比例懸浮于水,依次用石油醚、乙酸乙酯萃取.減壓濃縮乙酸乙酯部分,得浸膏,備用。流程見(jiàn)圖2.】。T 石油醚層1l坐星l-232硅腔柱層析2321樣品的預(yù)處理圖2-1浸膏分餾沆程圖將2.31中得到的乙酸乙酯層浸膏用適量甲醇溶解,加入2倍量層析用硅膠拌勻.揮干溶劑.研磨粉碎。2322裝柱裝柱的具體步驟為:按樣品與硅膠質(zhì)量比1:20.計(jì)算出硅膠的質(zhì)量,加入洗脫劑攪拌成勻漿,打開(kāi)柱下面的活塞,將勻漿沿壁倒入層析柱,讓柱中的溶劑軍罕昱F 蘭篙鹵向下移動(dòng),沉降硅膠,待硅膠層上的溶劑高度降低至3-4cm時(shí)關(guān)閉活塞。液面上塞一層棉花,目的是防止

2、大量加入洗脫劑時(shí)把硅膠屢沖的不平整。2323柱層析分離將2321中的樣品加到硅膠層析柱頂端,用氯仿/甲醇(v:V=I55:45作洗脫劑,每500mL接一瓶,用TLC點(diǎn)板,合并含相同組分的餾分。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑,得浸膏,用甲醇溶解,供分析型HPLC檢測(cè)和半制各HPLC分離。233分析HPLC色譜條件采用分析型HPLC法對(duì)合并后的樣品試樣進(jìn)行分析.以便跟蹤目標(biāo)物質(zhì)的位置以及對(duì)后續(xù)分離純化所得的樣品進(jìn)行純度檢測(cè),具體色譜條件如下:色譜柱:Acclaim R120CI s(250mmx46mml d,5gin;流動(dòng)相A:0.05%磷酸溶液,流動(dòng)相B:乙腈;梯度條件為015.2025.30-35.40.

3、60rain,2%一15%一155%一16%一18%一18%一20%.40%13:流速:1mLrain一:進(jìn)樣量:5uL:紫外檢測(cè)波長(zhǎng):260n/ll柱溫:30。234制備HPLC色譜條件采用制各型HPLC方法對(duì)經(jīng)硅膠柱層析分離的樣品進(jìn)一步純化,具體色譜條件如下:條件A,色譜杜:YMCPack ODSA(250mmxl0mm i d,5¨m:流動(dòng)相:乙腈(溶劑A/005%磷酸(溶劑B-20:80;流速:3mL min"1:進(jìn)樣量:20HL:檢測(cè)波長(zhǎng):260nm。條件B,流動(dòng)相:乙腈(溶劑A/005%磷酸(溶劑B=15:85,其余同條件A。235定性LCMS條件將純化的產(chǎn)品與

4、標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照,對(duì)比色譜峰的保留時(shí)間、紫外光譜圖進(jìn)行初步定性。并用LC.MS測(cè)定分子質(zhì)量進(jìn)一步驗(yàn)證色譜定性結(jié)果。色譜條件:流動(dòng)相為甲醇/002%甲酸-40:60,其余同2.33。質(zhì)譜條件:離子化方式為電噴霧離子化(ES r:正離子形式:掃描范圍:50800 mzl:霧化氣體流速:l5mLmin:接口溫度:200。2.4結(jié)果與討論24l黃酮類物質(zhì)的粗提取提取工藝流程I”I:魚(yú)腥草干草一90%乙醇提取3次_魚(yú)腥草浸膏一加適量水得懸浮液_+加石油中南大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章魚(yú)腥草中黃酮類物質(zhì)的分離和純化醚(按懸浮液/石油醚-32,萃取3次_分層;取水相_+加乙酸乙酯(按懸浮液/乙酸乙酯=3:2,萃取3

5、次_分層;取乙酸乙酯相濃縮_÷浸膏90%乙醇提取的魚(yú)腥草提取物中,組分復(fù)雜,包括強(qiáng)極性、中等極性、弱極性化合物,本實(shí)驗(yàn)的目的是提取分離其中的黃酮類化臺(tái)物,屬于中等極性的物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)選擇極性較小的石油醚和中等極性乙酸乙酯為萃取溶劑。首先用石油醚萃取,除去的是懸浮液中極性較小的物質(zhì),如脂類、色素等。乙酸乙酯是中等極性的溶劑,黃酮類化合物在其中有較好的溶解性,所以第二步使用乙酸乙酯萃取。由于黃酮類化臺(tái)物集中在乙酸乙酯層,所毗將該層萃取液在40永浴條件下進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),得到粘稠狀浸膏.把浸膏轉(zhuǎn)移到燒杯中,燒瓶?jī)?nèi)壁的浸膏用甲酵溶解下來(lái),也轉(zhuǎn)入燒杯中,將燒杯密封,放入冰箱內(nèi)保存,以便硅膠柱層析

6、分離使用。2.42硅膠柱洗脫劑的優(yōu)化采用硅膠柱層析對(duì)乙酸乙酯層浸膏進(jìn)行分離純化,首先通過(guò)TLC,尋找臺(tái)適的展開(kāi)劑作硅膠柱的洗脫荊。分別嘗試了氧仿/甲醇、石油醚/乙酸乙酯、乙酸乙Of,/丙酮、氧仿/甲醇/乙酸等溶劑體系。石油醚/乙酸乙酯體系,由于兩者都是極性較小的溶劑.所以用此體系作展開(kāi)劑時(shí),混合物的組分在板上移動(dòng)很少,基本都處于薄層扳的下端,無(wú)法分開(kāi).效果圖見(jiàn)圖2.2a。乙酸乙酯/丙酮體系,組分相對(duì)集中且成點(diǎn)不好,效果圖見(jiàn)圖22b。氯仿/甲醇/乙酸體系極性較大,使混合物的組分都跑到薄層板上端.也無(wú)法達(dá)到分離效果,見(jiàn)圖2.2c。氯仿,甲醇體系極性較為適中,但比例不同,分離效果也會(huì)有較大影響。氯仿

7、極性較小,甲醇極性較大,根據(jù)極性不同來(lái)調(diào)節(jié)體系中兩種溶劑的比例以得到最佳結(jié)果。試驗(yàn)中嘗試了18:2.17:3,16:4,146,15:5,165,】55 :55,155:45等比例。當(dāng)氯仿/甲醇=15.5:45時(shí),混合物中各組分在整個(gè)薄層板上分布較均勻,成點(diǎn)比較清晰。所以本實(shí)驗(yàn)選擇氯仿/甲醇=155:45混合溶液作為洗脫劑。樣品在用氯仿/甲醇-15545的溶液作為展開(kāi)劑的薄層色譜圖效果如圖2.2d所示。圖2-2薄層色譜圖fa.石油醚/o酸L酯:b.L酸L酯/丙酮:c一氧仿/甲醇/o酸;d-氯仿/甲醇12.43硅膠柱的部分分離用優(yōu)化好的洗脫劑將乙酸乙酯層浸膏經(jīng)硅膠柱洗脫,通過(guò)硅膠柱層析的洗脫分離,一共收集到179瓶(500lL/瓶,點(diǎn)板合并含相同組分的餾分,得到14瓶樣品,結(jié)果見(jiàn)表2.3