組培苗的玻璃化問(wèn)題

1、組培苗的玻璃化問(wèn)題日期：2010年4月1日來(lái)源：互聯(lián)網(wǎng)作者：植物組培網(wǎng)點(diǎn)擊：3026 在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí)，經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)試管苗生長(zhǎng)異常，表現(xiàn)為試管苗葉、嫩梢呈水晶透明或半透時(shí)，水浸狀；整株矮小腫脹、失綠；葉片皺縮成縱向卷曲、脆弱易碎；葉表缺少角質(zhì)層蠟質(zhì)，沒(méi)有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織。這種試管苗生長(zhǎng)異?，F(xiàn)象就是 P.Debergh（1981）首先命名的“玻璃化”（Vitrification）。是植物組織培養(yǎng)過(guò)程中所特有的一種生理失調(diào)或生理病變。      玻璃苗中因其體內(nèi)含水量高，干物質(zhì)、葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素和

2、森質(zhì)素含量低、角質(zhì)層、柵欄組織等發(fā)育不全，表現(xiàn)為光合能力和酶活性降低，組織畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很難繼續(xù)用作繼代培養(yǎng)和擴(kuò)大繁殖的材；生根困難，移栽后也很難成活。植物微體快速繁殖時(shí)玻璃苗的出現(xiàn)已成為一種很普遍的現(xiàn)象，該苗有時(shí)多達(dá)50%以上，嚴(yán)重影響繁殖率的提高，已成為莖尖脫毒、工廠化育苗和材料保存等方面的嚴(yán)重障礙，造成人、財(cái)、物的極大浪費(fèi)，所以試管苗下班化現(xiàn)象對(duì)植物組織培養(yǎng)的危害是相當(dāng)嚴(yán)重的，也是亟待解決的問(wèn)題。    （一）玻璃苗發(fā)生的因素      瓊脂和蔗糖濃度與玻璃化成負(fù)相

3、關(guān)，瓊脂或蔗糖濃度越高，玻璃苗的比率越低。Daniel&nbspG.&nbspW.&nbspBrown認(rèn)為玻璃化可能是培養(yǎng)基滲透勢(shì)不當(dāng)所致。碳源不僅為芽的形成提供能量，而且也起滲透調(diào)節(jié)作用，主要影響培養(yǎng)基的滲勢(shì)（Salisbury等）。隨瓊脂濃度及純度的增加，培養(yǎng)基硬度增加，從而影響其襯質(zhì)勢(shì)和水分狀況。Debergh等研究表明，液體培養(yǎng)基的水勢(shì)影響玻璃苗的形成，Ziv等認(rèn)為只要降低培養(yǎng)容器中的相對(duì)濕度，就可以降低玻璃苗的比例。劉思穎等（1988）測(cè)得絲石竹玻璃苗葉片的水勢(shì)約為正常苗的1.9倍，含水量為正常苗的2.09倍2.21倍。自由水和高濕度可能與肉質(zhì)嫩梢的形成有關(guān)。

4、Davis等研究表明，液體培養(yǎng)是導(dǎo)致玻璃化的主要原因?？梢詳喽?，試管苗玻璃化可能是培養(yǎng)基內(nèi)水分狀態(tài)不適應(yīng)的一種生理變態(tài)。      許多學(xué)者證明培養(yǎng)基中BA濃度和培養(yǎng)溫度與玻璃化成正相關(guān)，BA濃度越高或培養(yǎng)溫度越高，玻璃苗比率越大。 Debergh曾用14C-KT研究表明，隨瓊脂濃度的增加，KT利用率降低。同時(shí)也證明，隨BA濃度的增加，玻璃化率增加。Bornman等用14C- BA研究表明，14C-BA的積累與不定芽分化和玻璃化是同步的。玻璃化苗的一個(gè)重要特征是葉脈明顯加長(zhǎng)，而GA3也有類似效應(yīng)，也許GA3促進(jìn)了細(xì)胞過(guò)度生工，從而導(dǎo)致

5、玻璃化。生長(zhǎng)素可以改變細(xì)胞壁的機(jī)械特性，使其具有更大的可塑性。    許多研究表明，非受傷的物理和化學(xué)協(xié)迫可以增加乙烯的合成。玻璃化被認(rèn)為是一種非受傷協(xié)迫條件下形態(tài)上的反應(yīng)。玻璃苗苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性低于正常植株。在協(xié)迫條件下乙烯的快速合成，又通過(guò)抑制氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）酶的形成，對(duì)乙烯起反饋調(diào)節(jié)作用。通過(guò)改善氣體交換防止玻璃化形成，可能與克服乙烯反饋抑制有關(guān)。一種與膜有關(guān)的過(guò)氧化物酶直接或間接摻入ACC合成乙烯?，F(xiàn)已證明，IAA-氧化酶體系至少在乙烯合成的最后一步起作用。IAA含量降低將進(jìn)一步通過(guò)IAA調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸（SAM）轉(zhuǎn)化成

6、ACC這一過(guò)程，從而降低了乙烯形成。Kevers等曾證明，對(duì)于玻璃苗，堿性過(guò)氧化酶同功酶活性增加，而酸性同功酶活性降低。但總可溶性過(guò)氧化物酶活性增加，僅限于堿性提取物。有人認(rèn)為，玻璃化的形成主要是膜的效應(yīng)而與核酸無(wú)關(guān)。乙烯促進(jìn)了葉綠素分解及細(xì)胞的畸形發(fā)展。乙烯處理破壞了膜的結(jié)構(gòu)，隨著細(xì)胞壁解離，細(xì)胞內(nèi)積累有在量纖維素及泡狀物質(zhì)?？梢?jiàn)，乙烯對(duì)玻璃化的影響，與改變組織的生理生化及纖維結(jié)構(gòu)有關(guān)。      &nbspHakkart&nbspF.&nbspA. 等認(rèn)為玻璃苗是培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)氣體與外界交換不暢造成的。

7、密閉的封瓶口材料是導(dǎo)致玻璃化的原因之一（陳國(guó)菊等1992，李云等1996）。       培養(yǎng)基中高的含N量，特別是高的氨態(tài)N，也是導(dǎo)致玻璃化的因素。      有人發(fā)現(xiàn)不同部位的節(jié)段外植體與玻璃化有關(guān)，以留蘭香基部節(jié)段所形成的試管苗玻璃苗嚴(yán)重，中部莖段次之，莖尖最好（柴明良）；重瓣絲石竹中部莖段出現(xiàn)玻璃苗較多，基部莖段較少，莖尖沒(méi)有（郭達(dá)初）。郭東紅等（1989）認(rèn)為瑞香莖尖外植體大小與玻璃化相關(guān)，莖尖外植體越小，出現(xiàn)玻璃苗比率越大。  

8、60; （二）玻璃苗發(fā)生的機(jī)理       &nbspKevers 等的試驗(yàn)表明，蘋(píng)果砧木M7等的玻璃苗是由于過(guò)氧化物酶吲哚乙酸氧化酶系統(tǒng)控制的乙烯過(guò)飽和的影響，并認(rèn)為細(xì)胞激動(dòng)素和NH4+離子的過(guò)剩是一種最初的脅迫，受脅迫的試管苗在乙烯過(guò)剩的空氣中，抑制了乙烯的生物合成，結(jié)果降低苯丙氨酸解氨酶（PAL）和酸性過(guò)氧化物酶的活性，從而妨礙組織木質(zhì)化，導(dǎo)致形成玻璃苗。一種誘導(dǎo)協(xié)迫（過(guò)多的細(xì)胞分裂素和NH4+），可以通過(guò)酚含量的快速化調(diào)節(jié)不斷增加的過(guò)氧化物酶活性。乙烯的大量形成又對(duì)其自身起反饋抑制作用，結(jié)果PAL和

9、酸性過(guò)氧化物酶活性降低，從而抑制木質(zhì)化過(guò)程的進(jìn)行。糖用于氨基酸的合成，纖維素含量降低。由于缺乏纖維素和木質(zhì)素，壁壓降低，從而細(xì)胞過(guò)分吸水，并導(dǎo)致玻璃化。        張洪勝等認(rèn)為在試管苗玻璃化過(guò)程中，作為內(nèi)源激素的乙烯從代謝調(diào)節(jié)上起了關(guān)鍵性啟動(dòng)作用。而乙烯的產(chǎn)生則取決于培養(yǎng)環(huán)境中的脅迫條件，如水勢(shì)不當(dāng)，通氣不暢（造成缺氧）及培養(yǎng)基用BA量過(guò)高等，均會(huì)導(dǎo)致乙烯產(chǎn)生。乙烯產(chǎn)生后引發(fā)了其他激素質(zhì)和量上的改變及酶類的變化。因此，發(fā)生蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素的合成障礙及降解，葉綠素分解黃化，逐漸形成玻璃化癥狀；張昆瑜等（19

10、91）認(rèn)為乙烯克服試管苗玻璃化的機(jī)理是復(fù)雜的，在添加乙烯前體ACC（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸）和乙烯釋放劑CEPA（乙烯利）的培養(yǎng)基上證明乙烯對(duì)香石竹試管苗干物質(zhì)積累及組織、器官的發(fā)育有利。并發(fā)現(xiàn)ACC可促進(jìn)煙草愈傷組織中的過(guò)氧化物酶和苯丙氨酸裂解酶的活性，加強(qiáng)磷酸戊糖途徑與抗氰交替途徑，前兩個(gè)酶是促進(jìn)木質(zhì)素合成和細(xì)胞壁形成的關(guān)鍵酶，磷酸戊糖途徑與葉綠素前體的合成有關(guān)，抗氰交替途徑則降低了ATP的合成，從而抑制了過(guò)度主動(dòng)吸水，提高了蛋白質(zhì)和干物質(zhì)的含量。       李云等（1996）發(fā)現(xiàn)植物光呼吸途徑和磷酸戊糖（HMP）途

11、徑均與玻璃苗的產(chǎn)生有關(guān)，即當(dāng)上述兩條呼吸途徑的一條或兩條同時(shí)受阻時(shí)，均增加玻璃苗。密封瓶口、高溫、高濃度細(xì)胞分裂素等因子加快了生長(zhǎng)速度，加劇了瓶中氣體組成的改變，對(duì)瓶?jī)?nèi)外氣體交換提出更高要求，當(dāng)這種要求不能滿足時(shí)便出現(xiàn)玻璃化。HMP途徑的中間步驟與戊糖化合物代謝有關(guān)（如核酸合成），也與木質(zhì)素形成有關(guān)。當(dāng)HMP途徑被抑制時(shí)，壁的再生受抑制，戊糖化合物減少，核酸、蛋白質(zhì)合成受阻。當(dāng)光呼吸途徑被抑制時(shí)，減弱了光呼吸對(duì)光合的保護(hù)作用，過(guò)剩的同化物損壞了光合細(xì)胞器，不僅降低了光合作用，同時(shí)也阻礙了乙醇酸的的轉(zhuǎn)化，加重了乙醇酸對(duì)植物的毒害作用，從而導(dǎo)致玻璃化的產(chǎn)生。   &#

12、160;（三）防止和克服玻璃苗的措施      盡管關(guān)于玻璃化的成因及其生理機(jī)制到目前為止仍未得出一致的結(jié)論，但對(duì)某些植物的玻璃化已得到有效的控制。這些研究表明，控制玻璃化要從培養(yǎng)的環(huán)境條件和生理生化方面入手，具體措施如下：      利用固體培養(yǎng)，增加瓊脂濃度，降低培養(yǎng)基的襯質(zhì)勢(shì)，造成細(xì)胞吸水阻遏。提高瓊脂純度，也可降低玻璃化。      適當(dāng)提高培養(yǎng)基中蔗糖含量或加入滲透劑，降低培養(yǎng)基中的滲透勢(shì)，減少培養(yǎng)基中植物

13、材料可獲得的水分，造成水分脅迫。      降低培養(yǎng)容器內(nèi)部環(huán)境的相對(duì)濕度。      適當(dāng)降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和赤霉素的濃度。      控制溫度適當(dāng)?shù)蜏靥幚?，避免過(guò)高的培養(yǎng)溫度在晝夜變溫交替的情況下比恒溫效果好。      增加自然光照。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，玻璃苗放于自然光下幾天后莖、葉變紅，玻璃化逐漸消失，因自然光中的紫外線能促進(jìn)試管苗成熟，加快木質(zhì)化。

14、60;     增加培養(yǎng)基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu、Mn元素含量，降低N和Cl元素比例，特別降低銨態(tài)氮濃度，提高硝態(tài)氮含量。     改善培養(yǎng)容器的通風(fēng)換氣條件，如用棉塞或通氣好的封口膜封口。      青霉素G鉀（2mg/L6mg/L）能有效防治菊花試管苗的玻璃化（陳龍清等），青霉素（40萬(wàn)單位/升）可降低芥菜試管苗的玻璃化（陳國(guó)菊等）。      培養(yǎng)基中加入

15、間苯三酚或根皮苷。      用40熱擊（周菊華等）處理瑞香愈傷組織培養(yǎng)物，可完全消除再生苗的玻璃化，且能夠提高愈傷組織的芽分化頻率，熱擊處理會(huì)降低內(nèi)源細(xì)胞分裂素水平。      一些添加物可有效地減輕或防治玻璃化，如王家旺等添加馬鈴薯汁或活性炭降低了油菜玻璃苗頻率；郭達(dá)初等用10mg/L15mg/L的CCC或0.5mg /L1.0mg/L的PP333減少了重瓣絲石竹試管苗玻璃化的發(fā)生；師校欣等（1990）添加1.5g/L-2.0g/L的聚乙烯醇防治蘋(píng)果砧木玻璃化；張昆瑜等增加容器中乙烯含量克服香石竹玻璃化的發(fā)生。      盡管如此，不同植物在不同條件下，也許會(huì)得出不同的結(jié)論或相反的結(jié)果。更有效的玻璃化控制途徑，有等于進(jìn)一步研究。玻璃化是將某種物質(zhì)轉(zhuǎn)變成玻璃樣無(wú)定形體（玻璃態(tài)）的過(guò)程，是一種介于液態(tài)與固態(tài)之間的狀態(tài)，在此形態(tài)中沒(méi)有任何的晶體結(jié)構(gòu)存