黑色素瘤抗原MAGEA9基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)研究

1、黑色素瘤抗原MAGEA9基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)研究                          作者：于智勇, 薛慶於, 沈維干【摘要】  目的: 克隆MAGEA9基因并對其進(jìn)行真核表達(dá)及鑒定。方法: 通過逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RTPCR)從原發(fā)性肝癌的細(xì)胞中擴(kuò)增MAGEA9基因片段, 將該片段克隆在真核表達(dá)載體pEGFPC3中,

2、轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞, 經(jīng)G418篩選, 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系, 并用熒光顯微鏡和Western blot對其進(jìn)行鑒定。結(jié)果: 經(jīng)RTPCR擴(kuò)增出945 bp基因片段, 經(jīng)測序分析并與GenBank的DNA序列比對分析后, 在NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)。G418篩選后, 細(xì)胞熒光信號較強(qiáng), Western blot檢測, 細(xì)胞中的融合蛋白能夠與抗MAGEA9的多抗結(jié)合。結(jié)論: 成功地擴(kuò)增了肝細(xì)胞肝癌中的MAGEA9基因全長cDNA并進(jìn)行真核表達(dá)與鑒定。 【關(guān)鍵詞】  MAGE A9 真核表達(dá) 穩(wěn)定細(xì)胞系腫瘤細(xì)胞膜蛋白在腫瘤的發(fā)生、 和浸潤等方面發(fā)揮著重要作用, 特別是過表達(dá)的蛋白分子。自5

3、0年代以來, 科研工作者陸續(xù)在黑色素瘤為主的多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)一些腫瘤相關(guān)抗原, 從而成為腫瘤免疫快速發(fā)展的基礎(chǔ)1。黑色素瘤抗原基因（melanoma antigenencoding gene, MAGE）是首先從黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的一組腫瘤相關(guān)抗原, 其中MAGEA1基因編碼的MZ2E抗原是人類腫瘤中分離到的第1個腫瘤抗原。迄今發(fā)現(xiàn)MAGE基因家族的已知成員有25個, 各成員間的同源性達(dá)80%99%2。本研究中以原發(fā)性肝癌臨床標(biāo)本提取mRNA為模板, 真核表達(dá)了全長MAGEA9蛋白。1  材料和方法1.1  材料  肝細(xì)胞肝癌組織由江蘇省蘇北人民肝臟外科提供。TRIzo

4、l、 RTPCR試劑盒購自美國Invitrogen公司。膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen公司。G418和FuGENE 6購自Roche公司。小牛血清購自杭州四季清生物工程材料研究所。DMEM培養(yǎng)基購自Gibico公司。羊抗人MAGEA9多克隆抗體和鼠抗羊IgG抗體購自Santa cruz公司。ExTaq DNA聚合酶、 T4 DNA連接酶、 pDM18T simple vector購自大連寶生物工程公司。限制性內(nèi)切酶EcoR I、 Hind III為NEB公司產(chǎn)品。大腸桿菌TG1、 pEGFPC3和NIH3T3細(xì)胞為本實驗室保存。DNA序列分析由賽百盛公司完成。1.2 

5、方法1.2.1  引物的設(shè)計與合成  根據(jù)GenBank中MAGEA9基因序列設(shè)計引物片段, P1: 5GCAAGCTTCGGACTCCCTCTTCCTCCTCTCT3; P2: 5GCGGAATTCGAATGTCTCTTGAGCAGAGGAGT3, 分別引入Hind III和EcoR I酶切位點(diǎn), 由北京賽百盛公司合成。1.2.2  肝癌組織中總RNA的提取及MAGEA9基因的擴(kuò)增  取1例經(jīng)病理證實為肝細(xì)胞肝癌的手術(shù)切除標(biāo)本50 mg, 剪碎后加入1 mL TRIzol試劑, 勻漿后移到1.5 mL Eppendorf管中, 靜置10 min后加入2

6、00 L氯仿混勻, 靜置5 min, 12000 r/min, 4離心15   min, 取上清加入等體積的異丙醇沉淀RNA, DEPC處理水溶解沉淀。取5 L上述RNA溶液, RTPCR擴(kuò)增 MAGEA9基因。1.2.3  MAGEA9基因的測序與序列分析  PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳回收、 DNA膠純化試劑盒純化后, 與pDM18T simple vector連接, 經(jīng)藍(lán)白斑篩選, 陽性克隆經(jīng)PCR鑒定后, 由北京三博遠(yuǎn)志生物工程公司測定DNA序列。1.2.4  MAGEA9基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建  選取經(jīng)DNA序列測定和Blas

7、t比對分析正確的陽性克隆DNA, 按照報道的方式3, 用限制性內(nèi)切酶EcoR I、 Hind III消化處理并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、 DNA膠純化試劑盒純化目的基因片段, 與經(jīng)相同酶切處理、 純化的表達(dá)載體pEGFPC3相連接, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1, 擴(kuò)增陽性克隆并保存。1.2.5  MAGEA9的轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞  在6孔板中每孔加入2 mL NIH3T3細(xì)胞懸液, 含0.8×105個細(xì)胞/孔。24 h后分別加入2種混合液?；旌弦簶?gòu)成: pEGFPC3A9、 pEGFPC3質(zhì)粒各4 g, 與6 L FuGENE 6預(yù)先混合于DMEM, 使混合液總體積達(dá)到1

8、00 L。48 h后加入G418篩選, 濃度為500 mg/L。1周后篩選濃度改為100 mg/L。對轉(zhuǎn)染有包含綠色熒光蛋白的載體, 用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。細(xì)胞培養(yǎng)于含100 mL/L小牛血清、 100 mg/L青霉素和1000 U/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中, 在37, 含50 mL/L CO2濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.2.6  MAGE9的Western blot檢測  取對數(shù)生長期細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染載體pEGFPC3A9、 pEGFPC3。在含10 mL/L小牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h, 使細(xì)胞同步化后進(jìn)行處理。用含1 mg/L Leupeptin和0.5 mmol

9、/L PMSF的預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞, 用細(xì)胞刮器將細(xì)胞從培養(yǎng)板中刮落, 加入三去污細(xì)胞裂解液（50 mmol/L TriCl pH8.0, 150 mmol/L NaCl, 1 g/L Triton X100, 100 mg/L PMSF, 1 mg/L Aprotinin）置冰上30 min。超聲裂解處理3次, 每次10 s; 15000 r/min, 4離心30 min, 收集上清, 測其蛋白質(zhì)濃度, -70凍存。取各樣品50 g經(jīng)100 g/L SDSPAGE凝膠電泳, 再將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上, 室溫下用含50 g/L脫脂奶粉的PBS封閉1 h, 然后與羊抗人MAGEA9多克隆抗體4

10、孵育過夜, PBS液洗3次, 每次10 min, 加入HRP標(biāo)記的鼠抗羊IgG抗體, ECL檢測。2  結(jié)果2.1  RTPCR擴(kuò)增MAGEA9基因  臨床新鮮肝癌標(biāo)本經(jīng)細(xì)胞勻漿, 離心取上清與TRIzol混合, 按試劑盒說明提取mRNA, 以MAGEA9基因序列為合成的上、 下游序列設(shè)計合成的引物, 經(jīng)RTPCR擴(kuò)增后純化MAGEA9基因片段, 目的片段大小為945 bp（圖1）。1         圖1  MAGEA9基因RTPCR實驗結(jié)果（略）1: MAGEA9 DNA

11、; M: DNA marker.2.2  MAGEA9基因的DNA 序列分析  經(jīng)測序和Blast比對分析后, 序列正確的MAGEA9基因, 經(jīng)酶切、 純化后克隆于載體pEGFPC3中, 經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切鑒定后, 制備陽性重組載體pEGFPC3A9, 用于NIH3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。2.3  MAGEA9基因在重組載體pEGFPC3A9轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)  pEGFPC3A9轉(zhuǎn)染NIH3T3后細(xì)胞后經(jīng)熒光顯微鏡觀察, 結(jié)果顯示G418篩選前, 部分細(xì)胞顯示轉(zhuǎn)染成功, 有綠色熒光蛋白生成; 經(jīng)G418篩選后, 所有細(xì)胞均有綠色熒光蛋白生成（圖2）,

12、 表明真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系建成。圖2  MAGEA9基因在NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)（×100）（略）A: 熒光顯微鏡觀察pEGFPC3A9轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞中融合蛋白的表達(dá); B: 熒光顯微鏡觀察4,6二脒基2苯吲哚鹽酸（DAPI）pEGFPC3A9轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞中的細(xì)胞核; C: A和B圖的疊加圖.2.4  MAGEA9基因的表達(dá)的Western blot檢測  常規(guī)制備100 g/L的分離膠和50 g/L的積層膠, SDSPAGE電泳, 考馬斯亮藍(lán)染色。將經(jīng)定量分析后的細(xì)胞裂解液與SDSPAGE上樣緩沖液混勻處理后, 電泳、 

13、轉(zhuǎn)膜、 抗體結(jié)合并檢測。重組載體組與空載體相比, 陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞可見陽性蛋白條帶, 而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞未見相應(yīng)條帶（圖3）。圖3  Western blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的MAGEA9表達(dá)（略）1: MAGEA9在pEGFPC3A9穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的表達(dá); 2: MAGEA9在轉(zhuǎn)染pEGFPC3的細(xì)胞中的表達(dá); 3: MAGEA9在正常細(xì)胞中的表達(dá).3  討論    肝細(xì)胞癌在我國發(fā)病率高, 臨床療效及預(yù)后均很不理想, 近來針對肝細(xì)胞癌的肝癌發(fā)生相關(guān)基因的研究成為熱點(diǎn)。MAGE這類抗原在正常組織中除睪丸和胎盤組織外均不表達(dá), 但在某些原發(fā)性腫瘤和癌細(xì)胞中

14、, 如MAGEA1、 MAGEA2、 MAGEA3、 MAGEA4、 MAGEA6、 MAGEA10和 MAGEA12等高度特異性表達(dá)2, 4, 同時它們經(jīng)MHC1類分子提呈到細(xì)胞表面后, 可為自體細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)識別5, 6, 因而是CTL一種介導(dǎo)的特異性免疫的理想靶分子。MAGEA9 cDNA全長945 bp, 編碼Mr 35000的蛋白產(chǎn)物。本實驗中通過在真核細(xì)胞中克隆并表達(dá)MAGEA9基因。    MAGE基因最初發(fā)現(xiàn)于惡性黑色素瘤, 后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中都有表達(dá)7。Chomez等8發(fā)現(xiàn),

15、人皮膚傷口愈合過程第17天的新生組織中, MAGE基因有一過性表達(dá), 因此推測MAGE家族不僅僅和腫瘤有關(guān), 和組織細(xì)胞的正常生長和分化也相關(guān)。迄今為止的研究表明, MAGEA9的表達(dá)范圍與MAGEA家族的其他成員相比要小, 在食道腺癌、 膀胱癌等組織中發(fā)現(xiàn)表達(dá)2, 9。由于MAGEA9可以被一些化療藥物誘導(dǎo)表達(dá)9, 提示, MAGEA9有可能作為免疫治療或化療結(jié)合免疫治療的一個新的靶點(diǎn)。因此, 對MAGEA9基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立, 明確其在細(xì)胞中表達(dá)及定位, 這不但有助于對MAGEA9基因功能的研究, 對MAGEA9基因過表達(dá)腫瘤的免疫治療也具有重要意義。   

16、 本研究中利用RTPCR方法, 從人肝癌組織中克隆出目的基因全長片段, 經(jīng)測序確認(rèn)為MAGEA9基因, 構(gòu)建了真核表達(dá)載體pEGFPMAGEA9, 通過G418篩選, 建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。經(jīng)熒光檢測, 細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白。為了研究目的蛋白是否在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中表達(dá), 經(jīng)抗MAGEA9抗體的Western blot分析, 表明MAGEA9能夠在該細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)。該研究為進(jìn)一步研究MAGEA9細(xì)胞定位、 功能以及與腫瘤發(fā)生的關(guān)系奠定了實驗基礎(chǔ)?！尽?#160; 1 Zendman AJ, Ruiter DJ, Van Muijen GN. Cancer/testisassociated

17、 genes: Identification, expression profile, and putative functionJ. J Cell Physiol, 2003, 194(3): 272-288.2 Lin J, Lin L, Thomas DG, et al. Melanomaassociated antigens in esophageal adenocarcinoma: identification of novel MAGEA10 splice variantsJ. Clin Cancer Res, 2004, 10(17): 5708-5716.3 徐軍發(fā), 袁春雷,

18、 楊 衡, 等. 小鼠B7H4基因克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建J. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2007, 23(7): 665-667.4 Chomez P, Backer OD, Bertrand M, et al. An overview of the MAGE gene family with the identification of all human members of the familyJ. Cancer Res, 2001, 61(14): 5544-5551.5 Eichmuller S, Usener D, Thiel D, et al. Tumorspecific antigens in cutaneous Tcell lymphoma: expression and seroreactivityJ. Int J Cancer, 2003, 104(4): 482-487.6 Jungbluth AA, Busam KJ, Kolb D, et al. Expression o