高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白B表位誘導(dǎo)中和抗體能力的研究

1、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒 GP5蛋白B 表位誘導(dǎo)中和抗體能力的研究冷超糧 1,安同慶 1,陳家锃 1,宮大慶 1,李登云 1,楊永倩 1,彭金美 1,張祎 1,郭娟娟 1,吳江 1,童光志 2*,田志軍 1*(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150001;2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所,上海 200241摘 要:為證實 GP5蛋白 B 表位是否具有誘導(dǎo)抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV中和抗體的能力,本實驗合成了 PRRSV CH-1a 株和高致病性 PRRSV (HP-PRRSVHuN4株 B 表位的短肽,分別免疫家兔制備兩份特

2、異 性多肽抗血清 。 此外,將 12頭 PRRSV 及其抗體均為陰性的健康仔豬以 HP-PRRSV HuN4疫苗毒株 (HuN4-F112進 行基礎(chǔ)免疫,然后用強毒株 (HuN4-F5進行多次接種,制備豬高免血清 。 間接免疫熒光檢測 (IFA結(jié)果顯示,兩份 多肽抗血清均能與 PRRSV 經(jīng)典株和變異株發(fā)生特異性反應(yīng), IFA 抗體效價無差異,表明兩份血清沒有顯著差異 。 病毒中和試驗結(jié)果表明,兩份多肽抗血清均不具有中和 PRRSV 活性 。 間接 ELISA 和病毒中和試驗結(jié)果表明,豬 高免血清中針對 B 表位肽的 ELISA 抗體水平與血清抗 PRRSV 中和抗體之間沒有正相關(guān)關(guān)系,而且

3、B 表位肽不能 抑制中和抗體 。 以上結(jié)果表明 HP-PRRSV B 表位不能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體 。關(guān)鍵詞:HP-PRRSV ; GP5; B 表位;中和抗體 中圖分類號:S852.65文獻標(biāo)識碼:A文章編號:1008-0589(201104-0297-04The ability of B epitope in GP5protein of highly pathogenicPRRSV to induce neutralizing antibodyLENG Chao-liang 1, AN Tong-qing 1, CHEN Jia-zeng 1, GONG Da-qing 1, LI Deng-

4、yun 1, YANG Yong-qian 1,PENG Jin-mei 1, ZHANG Yi 1, GUO Juan-juan 1, WU Jiang 1, TONG Guang-zhi 2*, TIAN Zhi-jun 1*(1.State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001, China; 2. Shanghai Veterinary Researc

5、h Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 200241, ChinaAbstract:B epitope was considered as a major linear neutralizing epitope in the GP5protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSVclassical strains. Compared with the classical strains, however, one am

6、ino acid mutation (L39I was found in the B epitope of highly pathogenic PRRSV (HP-PRRSVstrains. To study the ability of the B epitope to induce neutralizing antibody (NAagainst HP-PRRSV, the B epitope peptides with and without the mutation (L39I were synthesized and immunized in rabbits to prepare t

7、he anti-peptide serums, respectively. Pig hyperimmune serums with high titer of NAs against PRRSV were prepared by hyperimmunization of swine with HP-PRRSV HuN4vaccine strain (HuN4-F112and virulent strain (HuN4-F5.Indirect immunofluorescence assay (IFAshowed that both rabbit anti-peptide serums had

8、positive reactivity to PRRSV CH-1a strain and HP-PRRSV HuN4strain in the infected cells, but didn't have virus neutralizing activity. Indirect ELISA 收稿日期:2010-12-05基金項目:國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973項目 (2005CB523202;獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室自主研究項目(SKLVBP201011作者簡介:冷超糧 (1984-,男,河南周口人,碩士研究生,主要從事動物病毒分子生物學(xué)研究 . *通信作者:E-mail

9、:gztong; tianzhijun01*Corresponding author中 國 預(yù) 防 獸 醫(yī) 學(xué) 報Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 33卷 第 4期 2011年 4月Vol. 33, No.4Apr. 2011doi:10.3969/j.issn.1008-0589.2011.04.11豬 繁 殖 與 呼 吸 綜 合 征 (Porcinereproductive and respiratory syndrome , PRRS 是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳 染病之一,在世界范圍內(nèi)廣泛存在 1。 PRRS 病毒 (PRRS

10、V是單股正鏈 RNA 病毒,為套病毒目動脈炎 病毒科動脈炎病毒屬成員 2。 2006年,我國出現(xiàn)了 高 致 病 性 PRRSV (Highlypathogenic PRRSV , HP-PRRSV 。 與經(jīng) 典毒株相比, HP-PRRSV 不僅具 有大量的點突變,而且在 NSP2蛋白上還有 30個氨 基酸的不連續(xù)缺失 3。Ostrowski 等 利 用 噬 菌 體 展 示 技 術(shù) 從 PRRSV VR-2332株的 GP5蛋白上鑒定出兩個表位,分別命 名 為 B 表 位 和 A 表 位 , B 表 位 的 序 列 為 37SHF/LQLIYNL 45,是一個主要線性中和表位 4, Plagma

11、nn 等則利用重疊合成肽技術(shù)驗證了該表位,并且發(fā)現(xiàn) 感染 PRRSV VR-2332的豬血清中針對該表位的抗體 與中和抗體具有正相關(guān)性 5。 此外,該表位還存在 于歐洲型 PRRSV 、 鼠乳酸脫氫酶增高癥病毒 (LDV和馬動脈炎病毒 (EAV的 GP5蛋白中 6。 與經(jīng)典毒 株相比, HP-PRRSV B 表位序列在 39位有一個氨基 酸突變 (L/F39I ,本實驗對該突變是否影響 B 表位誘 導(dǎo) 產(chǎn) 生 針 對 HP-PRRSV 中 和 抗 體 的 能 力 進 行 了 研 究 。1材料和方法1.1主要試驗材料經(jīng)典 PRRSV CH-1a 株由蔡雪輝研究員提供; HP-PRRSV HuN4

12、株 及 Marc-145細 胞均由本實驗室保存; 40日齡 50日齡新西蘭大 白兔購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動 物中心; 60日齡 80日齡長白豬購自哈爾濱市郊 區(qū)某 PRRS 陰性養(yǎng)殖場;弗氏佐劑 、 辣根過氧化物 酶 (HRP標(biāo) 記 的 兔 抗 豬 IgG 和 TMB 顯 色 液 均 購 自 Sigma 公司; FITC 標(biāo)記的山羊抗兔 IgG 購自北京康 為世紀(jì)生物科技有限公司 。 1.2多肽的合成及多肽抗體的制備PRRSV CH-1a株 B 表 位 序 列 37SHFQLIYNL 45和 HP-PRRSV HuN4株 B 表位序列 37SHIQLIYNL 45經(jīng)柔性氨基酸

13、GPGPG4次串聯(lián)后由南京金思特科技公司合成 7。 將合成肽 溶解為 1mg/mL,加入等體積的弗氏完全佐劑和弗 氏不完全佐劑充分乳化,頸背部皮下多點注射免疫 40日齡 50日齡新西蘭大白兔 。 免疫劑量為 500L/只 。 第一次免疫加弗氏完全佐劑乳化,此后免疫加 弗氏不完全佐劑,免疫間隔為兩周,三免后 14d 采 血,分離血清并于 -20 保存?zhèn)溆?。 1.3間接免疫熒光 (IFA檢測將 PRRSV CH-1a 株和 HP-PRRSV HuN4株分別接種 Marc-145細胞,待 出現(xiàn)明顯病變 (CPE時以 0.25%胰酶消化 、 冷丙酮 固定,將 制 備 的 多 肽 抗 血 清 按 不

14、同 比 例 稀 釋 后 檢 測 。 陽性對照血清為免疫 HP-PRRSV HuN4株制備 的多抗兔血清,陰性對照血清為免疫前兔血清 。 1.4多肽抗血清中和效價的測定將多肽抗血清按照不同的稀釋度進行倍比稀釋,血清稀釋前置 56 水浴中滅活 30min 。 取定量病毒液和等體積不同稀 釋度的血清混合, 37 水浴感作 1h 。 將病毒血清 混合物接種 96孔板培養(yǎng) 48h 后的 Marc-145細胞, 每孔 100L 含 100個 TCID 50。 37 培養(yǎng) 5d 后,判 定 CPE 。 采用 Reed-Muench 法計算中和效價 。 1.5豬高免血清的制備將實驗用 60日齡 80日齡 長

15、白 豬 首 先 免 疫 HP-PRRSV 弱 毒 活 疫 苗 株 (HuN4-F112,然后用 HuN4強毒株 (HuN4-F5進行 3次接種,在不同的時間點采血并制備血清,測定血 清中和效價 。 1.6B 表位肽與高免血清的 ELISA 反應(yīng)以合成肽為包被抗原,高免血清作為一抗,按常規(guī)方法建 立間接 ELISA 檢測方法 。 首先通過方陣滴定法確定 抗原包被濃度與血清的最佳稀釋濃度,并在此基礎(chǔ) 上進一步確定酶標(biāo)二抗的稀釋度,以確定最佳的工 作濃度 。 根據(jù)樣品孔 OD 450nm 測定值計算 P/N值,大 于 2.1判為陽性 。 陽性對照血清為 PRRSV B 表位抗 體陽性的豬血清,陰性對

16、照血清為 PRRSV 抗體陰 性的豬血清 。 1.7抑制中和試驗將按照不同濃度稀釋后的合成肽與豬高免血清充分混合,進行病毒中和試驗,確 定合成肽對豬高免血清中和抗體的抑制效果 。 對照and virus neutralization results indicated that there was no significant correlation between the anti-B epitope peptide antibodies and NA in pig hyperimmune serums. Base on these findings, we conclude that th

17、e B epitope of GP5protein in HP-PRRSV can not induce NA.Key words :highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus; GP5; B epitope; neutralization antibody中 國 預(yù) 防 獸 醫(yī) 學(xué) 報 2011年298為不含合成肽的 PBS 緩沖液 。 2結(jié) 果2.1多肽抗血清與 CH-1a 株和 HuN4株的 IFA 檢測結(jié)果將 PRRSV CH-1a 和 HP-PRRSV HuN4的 B表位合成肽分別免疫新西

18、蘭白兔制備了兩份多肽抗 血清,命名為 S1和 S2。 IFA 結(jié)果表明,兩份血清 均能與 HuN4株和 CH-1a 株感染的 Marc-145細胞發(fā) 生特異性的熒光反應(yīng), IFA 效價沒有顯著差異 (圖 1; 表 1 。 結(jié)果表明 39位氨基酸的變異 (L/F39I 對 B 表 位的抗原性沒有影響 。2.2多肽抗血清中和效價的測定 兩份多肽抗血清最低倍數(shù) (2倍 稀釋后與 100個 TCID 50病毒混合感 作后接種細胞,結(jié)果都觀察到了明顯的 CPE ,表明 兩份血清都沒有中和活性 (表 1 。2.3豬高免血清中針對 B 表位合成肽的 ELISA 抗體水平與血清中和抗體水平之間的相關(guān)關(guān)系經(jīng)方陣

19、滴定法確定,抗原最佳包被濃度為 1g/mL,高 免血清的稀釋度為 1 50。 間接 ELISA 和病毒中和試 驗結(jié)果表明,同一頭豬不同時期高免血清中針對 B 表位肽的抗體水平與血清中和抗體水平之間沒有正 相關(guān)關(guān)系,而且不同豬之間高免血清中針對 B 表位 肽的抗體水平與血清中和抗體水平之間也沒有正相 關(guān)關(guān)系 (圖 2;表 2 。2.4抑制中和試驗 加入合成肽的高免血清與對照組同等條件下進行中和試驗,結(jié)果顯示兩組之間未 形成顯著差異,表明合成肽沒有明顯的抑制效果 。3討 論B 表位是目前在 PRRSV GP5蛋白上發(fā)現(xiàn)的唯一 的中和表位,并一直被認(rèn)為是主要的中和表位 4-5。 我 國 出 現(xiàn) 的

20、HP-PRRSV HuN4株 的 B 表 位 與 經(jīng) 典表 1多肽抗血清與 PRRSV HuN4株和 CH-1a 株反應(yīng)的 IFA 效價及中和效價Table 1he IFA titer and neutralization titer of anti-peptide serums reacted with PRRSV HuN4strain and CH-1a strain血清 Serums S1S2PCPRRSV 毒株 PRRSV strains HP-PRRSV HuN4PRRSV CH-1a HP-PRRSV HuN4PRRSV CH-1a HP-PRRSV HuN4PRRSV CH-1a

21、病毒中和效價 VN titer <1:2<1:2<1:2<1:2<1:2<1:2IFA 效價 IFA titer 1:801:801:801:801:3201:320表 2不同豬之間高免血清中針對 B 表位肽的抗體水平與血清中和抗體水平Table 2The levels of anti-B epitope peptide antibodies and NAs in hyperimmune serums of different pigs detected by indirect ELISA and virus neutralization test, res

22、pectively010203040506070809101112抗 B 表位肽抗體水平 (P/NThe level of anti-Bepitope peptide antibody(P/N2.0120.3710.3920.3611.7350.2360.4382.4310.4880.2440.7600.3511:1001:24001:121:81:1261:321:81:201:1121:631:1601:397病毒中和效價 VN titer血清編號 Serum NO.冷超糧,等 . 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒 GP5蛋白 B 表位誘導(dǎo)中和抗體能力的研究 第 4期 299PRRSV VR

23、-2332株相比, 39位有一個氨基酸的突變 (L/F39I 。 本研究合成了 PRRSV CH-1a 株和 HP-PRRSV HuN4株的 B 表位短肽,分別免疫家兔制備了兩份 多肽抗血清 S1和 S2。 IFA 結(jié)果顯示,兩份血清都 能 與 PRRSV CH-1a 株 和 HP-PRRSV HuN4株 反 應(yīng) , 并且 IFA 效價沒有顯著差異 。 這表明 39位的氨基 酸變異對該 表 位 的 抗 原 性 沒 有 影 響 。 中 和 試 驗 顯 示,血清 S1和 S2均沒有中和活性 。 Plagemann 將 含有 B 表位序列的合成肽免疫小鼠制備的血清也沒 有中和活性,推測合成肽上氨基酸

24、的組成與天然狀 態(tài)相比可能有差異 8。本研究將 PRRSV 及其抗體均為陰性的健康仔 豬,首先免疫 HuN4-F112疫苗株,然后接種強毒株 HuN4-F5,制備出了中和效價最高達 1 2400的多份 高免血清 。 研究結(jié)果表明,高免血清中針對 B 表位 肽的抗體水平與血清中抗 PRRSV 中和抗體水平之 間沒有正相關(guān)關(guān)系 。 此外,將合成肽與高免血清混 合感作后再進行中和試驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)合成肽沒有明 顯的抑制效果 。 之前有研究認(rèn)為,健康豬自然感染 PRRSV 制備的血清中,針對 B 表位的抗體水平與中 和抗體水平之間具有正相關(guān)關(guān)系 5。 本研究制備的 多份中和效價很高的血清中幾乎檢測不到針對

25、 B 表 位的抗體,并且合成的 B 表位肽沒有抑制效果,表 明 HP-PRRSV B 表位不能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體 。目前,中和抗體的治療作用在 PRRSV 方面已有 研究 。 感染 PRRSV 的豬注射具有中和活性的單克 隆抗體或多克隆抗血清后,病毒血癥能夠得到明顯 的降低或消除 。 被動轉(zhuǎn)移的中和抗體能夠形成消除 性免疫,阻止或消除病毒在妊娠母豬以及仔豬上的 感染 9-10。 本研究制備的中和效價達 1 2400的高免 血清及其制備程序,均是國內(nèi)外首次報道,可以為 某些具有高感染風(fēng)險的豬場提供緊急保護,也可以 用來治療感染的病豬 。PRRSV GP5蛋白一直被認(rèn)為是研制 PRRSV 基 因工程

26、疫苗最理想的候選蛋白,而 B 表位又是該蛋 白上一個主要的中和表位 5-6,11。 本研究嘗試通過研 究 B 表 位 誘 導(dǎo) 產(chǎn) 生 中 和 抗 體 的 能 力 來 尋 找 設(shè) 計 HP-PRRSV 基因工程疫苗的理想抗原,但本實驗結(jié) 果表明在血清中和抗體產(chǎn)生過程中, B 表位沒有發(fā) 揮主要作用, HP-PRRSV 的何種抗原在中和抗體產(chǎn) 生中發(fā)揮著主要作用,有待于進一步研究 。 參考文獻:Neumann E J, Kliebenstein J B, Johnson C D, et al. Assessment of the economic impact of porcine reprodu

27、ctive and respiratory syndrome on swine production in the United States J.J Am Vet Med Associa , 2005, 227:385-392.Albina E. Porcine reproductive and respiratory syndrome:ten years of experience (1986-1996 with this undesirable viral infection J.Vet Res, 1997, 28:305-352.Tong Guang-zhi, Zhou Yan-jun

28、, Hao Xiao-fang, et al. Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome, China J.Emerg Infect Dis, 2007, 13(9:1434-1436.Ostrowski M, Galeota J A, Jar A M, et al. Identification of neu-tralizing and nonneutralizing epitopes in the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP

29、5ectodomain J.J Virol, 2002, 5:4241-4250.Plagemann P G W, Rowland R R R, Faaberg K S. The primary neutralization epitope of porcine respiratory and reproductive syndrome virus strain VR-2332is located in the middle of the GP5ectodomain J.Arch Virol, 2002, 147:2327-2347.Plagemann P G W. GP5ectodomain epitope of porcine repro-ductive and respiratory syndrome virus, strain Lelystad virus J. Virus Res, 2004, 102, 225-230.Hua Rong-hong, Zhou Yang-jun, Wang Yun-feng, et al. Identifi-cation of two antigenic epitopes on SARS-CoV spike protein J. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 319:929-935.Plagemann