RhoARho激酶信號通路在血管緊張素Ⅱ刺激心肌成 纖維細胞

1、    作者：汪祥海， 伍衛(wèi)， 楊軍， 方昶， 耿登峰， 黃至斌【摘要】  【目的】 探討RhoA/Rho激酶信號通路在血管緊張素（angiotensin，Ang）刺激心肌成纖維細胞（ cardiac fibroblasts，CFBs）增殖和膠原合成中的作用。【方法】 采用胰酶消化、差速貼壁法培養(yǎng)新生SD 大鼠CFBs,并用Ang誘導CFBs增殖和膠原合成。采用四氮唑鹽比色法測定細胞增殖,羥脯氨酸法測定CFBs膠原含量,RT-PCR檢測RhoA/Rho激酶mRNA的表達，Western blot檢測肌球蛋白結合亞基磷酸化（phosph

2、orylation of myosin-binding subunit,MBS-P）表達作為Rho激酶功能活化的標志?！窘Y果】 Ang(10-7mol/L )刺激48 h可誘導新生SD大鼠CFBs的Rho激酶活化（< 0.01），上調RhoA、Rho激酶mRNA表達(0.05），但可抑制Ang誘導的MBS-P蛋白表達?？梢?，Ang可誘導Rho激酶活化， H4413對Ang誘導的Rho激酶活化具有抑制作用。    2 4   Ang對鼠心肌CFBs增殖和膠原合成的影響及H4413干預    方差分析結果示Ang與H4413對SD大

3、鼠CFBs的CFBs增殖和膠原合成有交互效應（F=5.24和6.41）, 10-7 mol/L Ang刺激大鼠心肌成纖維細胞48 h后, MTT (A490值)和膠原合成量均顯著增高（F=7.38和8.51），10-5 mol/L H4413預處理對A490值和膠原合成量無顯著影響（F=0.046和1.27），但可抑制Ang的作用(表2)。    3   討   論    心肌成纖維細胞（CFBs）增殖和膠原合成在心肌纖維化中起重要作用，心肌纖維化又是心功能由代償向失代償期轉變的重要病理過程3。

4、Ang是促進心肌成纖維細胞（CFBs）增殖、膠原合成的一個重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，10-7mol/L Ang具有促進CFBs增殖活力和膠原合成作用，這與國內外許多作者的研究相一致4，5。但Ang刺激CFBs增殖和膠原合成受體后的確切的胞內信號轉導機制目前尚未完全清楚。    小分子Rho GTP 酶家族具有廣泛的生物學功能,除了對細胞骨架重排有重要調控作用外,亦參與調節(jié)細胞的局部黏附、遷移、聚集、增殖和基因轉錄等1，6。新近有研究發(fā)現(xiàn)，Rho 激酶可能參與調控Ang誘導心肌肥厚和血管平滑肌肥大7,另有文獻報道 RhoARho 激酶通路與SHR大鼠心血管重構及小鼠心肌梗死后左室

5、重構有關，長期抑制Rho 激酶可顯著改善心血管重構2,8。    本研究在培養(yǎng)的新生SD大鼠CFBs上觀察到，Ang（10-7 mol/L）在刺激CFBs增殖、膠原合成的同時可激活Rho 激酶，并明顯上調CFBs的RhoA和Rho 激酶mRNA的表達水平，提示在Ang刺激CFBs增殖和膠原合成中RhoARho 激酶信號通路被活化。Hydroxyfasudil（H4413）是RhoARho 激酶信號通路高度特異性的抑制劑,常應用于該信號通路的功能研究9,我們用H4413 10-5 mol/L預處理CFBs，結果發(fā)現(xiàn)， H4413與Ang對大鼠CFBs的Rho激酶活化和RhoA

6、、Rho激酶mRNA表達有交互效應, 10-5 mol/L H4413可顯著抑制10-7 mol/L Ang刺激的CFBs增殖與膠原合成。從上述結果我們可以推論出，Ang刺激CFBs增殖和膠原合成至少部分是通過RhoARho 激酶信號通路所介導。    RhoARho 激酶通路可能并非Ang誘導CFBs增殖、膠原合成唯一的胞內信號轉導通路，有學者報道，Ang可通過結合AT1受體,以酪氨酸激酶途徑激活細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)引起心肌纖維化9；另有文獻報道，Ang可通過增加心肌成纖維細胞MAPK活性和DNA合成刺激轉化生長因子1 mRNA表達和蛋白合成的增加，進而引起心肌纖

7、維化10。在調控Ang刺激的CFBs增殖和膠原合成中，RhoARho 激酶通路與ERK、MAPK間的信號轉導關系有待進一步明確。    Rho 激酶有兩種同源性極高的異構體形式 (ROCK/ ROCK 2 和ROCK/ ROCK 1)，新近，利用基因敲除技術，有學者發(fā)現(xiàn)ROCK1在壓力負荷致心肌間質纖維化中起重要作用11。在調控Ang刺激的CFBs的增殖和膠原合成中，何種Rho 激酶亞型起主要作用，亦有待進一步研究?！緟⒖嘉墨I】  BURRIDGE K, WENNERBERG K. Rho and Rac take center stageJ. Cell

8、, 2004,116(2):167-179.LOIRAND G, GUERIN P, PACAUD P, et al. Rho kinases in cardiovascular physiology and pathophysiologyJ. Circ Res, 2006,98(3):322-334.GALLAGHER A M, BAHNDON T D, YU H, et al. Species variability in angiotensin receptor expression by cultured cardiac fibroblasts and the infracted he

9、artJ. Am J Physiol, 1998,247(3 pt 2):H 801-809.張 偉, 楊 濤, 蘇彥欣, 等. 雙苯氟嗪對血管緊張素誘導新生大鼠心肌成纖維細胞增殖和膠原合成的影響及其機制研究 J. 中國藥理學通報,2006,22 (2):207-212.KAWANO H, DO Y S, KAWANO Y, et al. Angiotensin has multiple profibrotic effects inhuman cardiac fibroblastsJ. Circulation,2000,101(10):1130 - 1137.TAKEUCHI S, KAWAS

10、HIMA S, RIKITAKE Y, et al . Cerivastatin suppresses lipopolysaccharide?鄄induced ICAM-1 expression through inhibition of Rho GTPase in BAECJ. Biochem Biophys Res Commun , 2000,269 (1): 97-102.HIGASHI M, SHIMOKAWA H, HATTORI T, et al. Long?鄄term inhibition of Rho-kinase suppresses angiotensin ?鄄induce

11、d cardiovascular hypertrophy in rats in vivo: effect on endothelial NAD(P)H oxidase systemJ. Circ Res，2003,93(8):767-775.HATTORI T, SHIMOKAWA H, HIGASHI M, et al. Long?鄄term inhibition of Rho?鄄kinase suppresses left ventricular remodeling after myocardial infarction in miceJ. Circulation, 2004 ,109(

12、18):2234-2239. MIURA M, HATA Y, HIRAYAMA K, et al. Critical role of the Rho-kinase pathway in TGF-beta2-dependent collagen gel contraction by retinal pigment epithelial cellsJ. Exp Eye Res, 2006, 82(5):849-859.ZOU Y, KOMURO I, YAMZZAKI T, et al. Cell type-specific angiotensin ?鄄evoked signal transduction pathways: critical roles of Gbetagamma subunit, Src family, and Ras in cardiac fibroblastsJ. Circ Res, 1998, 82(3):337-345.KAWANO H, DO Y S, KAWANO Y, et al. Angiotensin has multiple profibrotic effects in human cardiac fibroblastsJ. Circulation, 2000,101 (10):11