聚乙二醇修飾鼠抗人CD3單克隆抗體

1、聚乙二醇修飾鼠抗人CD3單克隆抗體         11-01-30 11:16:00     編輯：studa20                  作者：馬杭圣, 王 鴻, 孫漢棟, 易喻, 應(yīng)國(guó)清【摘要】  目的: 確定一條聚乙二醇化鼠抗人CD3單克隆抗體（mAb）和抗體片段的制備工藝路線(xiàn)。方

2、法: 以胃蛋白酶酶解并通過(guò)凝膠柱分離和純化得到抗體Fab, 利用PEGSPA修飾抗體和抗體片段Fab上的氨基, 通過(guò)體內(nèi)和體外T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn), 考查修飾后的抗體和抗體片段的免疫活性。結(jié)果: 較佳的修飾工藝條件為: 在pH9.0硼酸緩沖液, 反應(yīng)溫度25, 抗體濃度0.2 g/L, 抗體和聚乙二醇摩爾比為120, 反應(yīng)3 h。修飾后抗CD3 mAb全抗, 對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖抑制活性下降了32.3%, 抗體Fab下降了8.0%, PEG化Fab下降了19.9%。利用ELISA檢測(cè)血液中修飾后的抗體和抗體片段的半衰期。結(jié)果顯示mPEG修飾后抗體和抗體片段血藥濃度降低明顯減緩, 修飾后抗CD3抗體半衰期

3、從2.66 h延長(zhǎng)到8.72 h, 延長(zhǎng)了3.28倍。而修飾后抗體Fab片段半衰期從2.21 h延長(zhǎng)到4.17 h, 延長(zhǎng)了1.90倍。結(jié)論: 利用聚乙二醇修飾抗體和抗體片段, 提高了抗體半衰期, 且無(wú)細(xì)胞毒性, 活性損失較小, 該技術(shù)具有較高的可行性, 可極大地提高mAb尤其是非人源性抗體在臨床上的應(yīng)用。 【關(guān)鍵詞】  單克隆抗體; CD3; 聚乙二醇; 化學(xué)修飾; 免疫活性    鼠抗人抗CD3 單克隆抗體（mAb）因具有毒副作用少、 使用劑量低、 半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn), 而在器官移植領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。但鼠抗人抗CD3 mAb也存在很多缺點(diǎn), 最主要

4、的是該抗體是鼠源性, 器官移植患者單獨(dú)使用該抗體治療后57 d , 機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的特異性體液免疫反應(yīng), 導(dǎo)致其被快速清除, 半衰期明顯縮短, 限制了其治療效果。目前國(guó)內(nèi)外普遍采用聚乙二醇(PEG)化學(xué)修飾1來(lái)起到藥物毒副作用減少、 半衰期延長(zhǎng)、 免疫源性降低的目的2, 3, 并且修飾后的藥物也被各國(guó)藥監(jiān)部門(mén)認(rèn)可, 并批準(zhǔn)上市。我們利用胃蛋白酶酶解抗體制備抗體Fab, 并對(duì)PEG修飾鼠抗人抗CD3 mAb和Fab片段的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化, 探討了各因素對(duì)修飾度大小影響, 再對(duì)獲得的PEG化抗體及Fab片段的體內(nèi)體外生物活性功能進(jìn)行了初步研究。    1  材

5、料和方法    1.1  材料  清潔級(jí)ICR雄性小鼠20 g購(gòu)于浙江省醫(yī)藥科技學(xué)院, 鼠抗人CD3 mAb購(gòu)于北京天廣實(shí)生物技術(shù)有限公司, 牛血清白蛋白(BSA), Sephadex G75, sephadex G25, TNBS, 碘乙酰胺等購(gòu)于Sigma公司, PEG5000SPA購(gòu)于北京凱正生物技術(shù)有限公司, 巰基乙醇購(gòu)于博大泰克公司, 辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司, 無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液、 噻唑蘭(MTT)、 伴刀豆球蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司

6、。    1.2  方法    1.2.1  抗CD3mAb的純化  取鼠抗人CD3mAb, 置于截留相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為100 000的Amicom 30超濾膜離心管(美國(guó)Amicom 公司產(chǎn)品)超濾分離, 4 500 r/min, 15 min離心濃縮除去牛血清白蛋白, 加入0.1 mol/L  pH7.4  PBS稀釋, 計(jì)算IgG回收率。    1.2.2  抗CD3mAb F(ab)2 及Fab片段的制備和純化  利用胃蛋白

7、酶分解IgG, 將抗體斷鏈為Fab和Fc片段4。即取結(jié)晶胃蛋白酶3 mg, 溶于0.1 mol/L pH4.0醋酸緩沖液500 mL中, 取抗CD3 mAb (1 g/L)100 L, 加入1 mL上述溶液中。于30作用16 h。置于截留Mr為50 000的Amicom 30超濾膜離心管(美國(guó)Amicom 公司產(chǎn)品), 4 500 r/min, 15 min離心濃縮, 加入0.1 mol/L   pH7.4  PBS緩沖液過(guò)夜。以上清過(guò)Sephadex G75(40 cm×1.0 cm)以0.1 mol/L  PBS緩沖液洗脫, 得抗CD3 m

8、Ab F(ab)2片段。將上述收集液, 加入硫醇使成0.1 mol/L, 在室溫下攪拌30 min。加入1 mol/L的碘乙酰胺（Indoacetamide）使成為0.1 mol/L, 室溫下攪拌1 h。置于截留Mr為30 000的Amicom 30超濾膜離心管(美國(guó)Amicom 公司產(chǎn)品) ,  4 500 r/ min,  15 min離心濃縮, 加入0.1 mol/L  pH7.4  PBS過(guò)夜。以上清過(guò)SephadexG75(40 cm×1.0 cm)收集。得抗CD3 mAb Fab片段。分別測(cè)A280和A260值, 計(jì)算蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度

9、(g/L)1.45（A280）-0.74（A260）, 并計(jì)算回收率。    1.2.3  PEG化抗CD3mAb和抗體片段的制備  取適量PEG5000SPA加入鼠抗人CD3 mAb和抗體片段5, 6, 在不同的條件下進(jìn)行反應(yīng), 過(guò)排阻柱分離純化。平均氨基修飾度測(cè)定采用TNBS法對(duì)修飾抗體進(jìn)行平均氨基修飾度測(cè)定。氨基修飾率= 1-氨基殘留率(%) 。表1  L9（34）試驗(yàn)因素水平    1.2.4  PEG化抗CD3mAb和抗體片段的體外免疫活性和細(xì)胞毒性檢測(cè)  MTT法測(cè)定: 取

10、常規(guī)制備小鼠脾細(xì)胞懸液, 用無(wú)血清RPMI1640 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×1010/L, 加于96 孔培養(yǎng)板每孔加板50 L, 前4排不加刺激源, 后8排分別加入ConA和LPS（刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖）, 再將PEG化抗CD3 mAb和抗體片段以原濃度為0.2 g/L, 以不同濃度加入37、 50 mL/L  CO2培養(yǎng)44 h, 各孔加入MTT（2 g/L, PBS溶解）50  L/孔, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h。1 800 r/min離心5 min, 棄去各孔內(nèi)液體, 加含2%4% 1 mol/L鹽酸的DMSO溶液150  L/孔, 置暗處室溫震蕩153

11、0 min, 酶標(biāo)儀492 nm處測(cè)A值。計(jì)算SI公式為: SI=（A刺激孔-A本底）/（A正?？?A本底）。    1.2.5  PEG化抗CD3mAb和抗體片段的體內(nèi)免疫活性的檢測(cè)  遲發(fā)性超敏反應(yīng)測(cè)定: 取65只清潔級(jí)ICR小鼠(1820 g), 分成13組, 用硫化鈉腹部脫毛, 將新配制的DNFB丙酮麻油溶液50 L均勻涂抹腹部脫毛處致敏。致敏當(dāng)天,  致立即腹腔注射(ip), 其中1組注射生理鹽水, 另外12組每組分別注射不同藥物3個(gè)劑量(高、 中、 低分別為0.2、  0.04、 0.008 g/L, 以0.1

12、mL/10 g體質(zhì)量注射, 隔天注射。致敏第5天,  用新配制的DNFB丙酮麻油溶液10 L 均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進(jìn)行攻擊。攻擊后 24 h 頸椎脫臼處死小鼠, 剪下左右耳殼。用打孔器取下直徑8 mm的耳片, 稱(chēng)質(zhì)量。    1.2.6  PEG化抗CD3mAb和抗體片段的體內(nèi)半衰期的檢測(cè)  取家兔4只（12 kg）, 分別靜脈注射(iv)不同的藥物0.1 mg/kg, 2 mL, 分別于0、 0.5、 1、 2、 4、 8、 12、 24、 48 h取血1 mL, 將血樣離心30 min 后分離血清,  -20保存待

13、測(cè)。ELISA法測(cè)定: 待測(cè)血清用PBS稀釋成1125, 1250, 1500, 11 000, 12 000, 14 000加到96孔培養(yǎng)板, 每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1 mL。用0.05 mol/L  pH9.6碳酸鹽包被緩沖液將待測(cè)血清進(jìn)行包被。4過(guò)夜(同時(shí)做空白孔, 陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)。次日, 棄去孔內(nèi)溶液, 用PBSTween20 (PBST)緩沖液洗滌3次, 每次3 min。加10 g/L BSA  0.1 mL于上述已包被反應(yīng)孔中, 置37孵育1 h。然后洗滌。于各反應(yīng)孔中, 加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度為15 000) 0.1 mL。

14、37孵育0.51 h, 洗滌。于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的OPD底物溶液0.1 mL, 37避光反應(yīng)1030 min,  加入2 mol/L硫酸0.05 mL終止反應(yīng),  在酶標(biāo)儀上測(cè)定495 nm吸光值。血藥濃度進(jìn)行藥物動(dòng)力學(xué)分析。    2  結(jié)果    2.1  抗CD3mAb的純化  利用考馬氏亮藍(lán)法, 測(cè)定超濾膜分離前后的蛋白質(zhì)濃度,  IgG回收率為84.03%。    2.2  抗CD3mAb Fab片段的制備和純化  經(jīng)葡聚糖G75凝膠柱排阻分離后, 有明顯的二個(gè)峰, 第1個(gè)峰為雙硫鍵未被打斷的抗CD3mAb F(ab)2,  第2個(gè)峰為本實(shí)驗(yàn)所要獲得的Fab片段峰（圖1）。收集第1016管過(guò)濾液, 超濾濃縮, 利用吸收差公式得到: 抗體片段Fab蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（g /L）1.45×0.582-0.74×0.2660.647 g/L?？贵w片段Fab回收率=0.647/1.0×100%=64.7%。未被酶解的抗CD3 mAb（1列）Mr在200 000以上,  155 000附近出現(xiàn)了蛋白帶（200 000以上的條帶應(yīng)該是抗體的多聚物