急性淋巴細胞白血病患兒紅血球中6-巰基嘌呤及其代謝產(chǎn)物的

1、急性淋巴細胞白血病患兒紅血球中6巰基嘌呤及其代謝產(chǎn)物的HPLC分析項目完成人：牟德海 鄭家概 閆世平 辜英杰 喻凌寒項目完成單位：中國廣州分析測試中心 廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室6巰基嘌呤（6-mercaptopuring, 6MP）和硝基咪唑硫嘌呤（azathiopurine, Aza）主要作為抗腫瘤藥用于治療急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia, ALL），或者作為免疫抑制劑用于治療炎性腸病、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和抑制器官移植病人的急性排斥。Aza是6MP的1甲基4硝基5咪唑硫衍生物，在體內(nèi)降解生產(chǎn)6MP，Aza抗腫瘤和免疫抑制的藥物

2、活性主要是來自其降解產(chǎn)物6MP的代謝產(chǎn)物。圖1. 6巰基嘌呤的代謝16MP在體內(nèi)的代謝主要有三條途徑：（1）在次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的作用下轉(zhuǎn)化為6硫次黃嘌呤核苷一磷酸（6-thioinosine monophosphate，TIMP），TIMP隨后在一系列酶促反應(yīng)中轉(zhuǎn)化為活性代謝物6硫鳥嘌呤核苷（6thioguanine nucleotides, 6TGNs）發(fā)揮細胞毒作用；（2）在硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（thiopurine methyltransferase，TPMT）作用下轉(zhuǎn)化

3、為無藥物活性的甲基硫嘌呤（6methylmercaptopurine, 6MMP）;（3）在黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）作用下轉(zhuǎn)化為6硫尿酸（6thiouric acid, 6TUA）1，見圖1。與6MP轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物性6TGNs相競爭的有兩條途徑：在TPMT作用下轉(zhuǎn)化為6MMP和在XO作用下轉(zhuǎn)化為6TUA。XO活性在個體之間的差異不大，而TPMP活性在不同個體之間有很大的差異。因而病人對6MP反應(yīng)（即藥物的療效和毒性）的差異主要決定于其體內(nèi)TPMT的活性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)紅細胞中6TGNs的含量與TPMT的活性呈負相關(guān)關(guān)系。在標準用藥劑量下，TPMT活性低的個體能積累高

4、濃度的6TGNs導(dǎo)致致死性的骨髓細胞毒性。相反TPMT活性高的個體對硫嘌呤類藥物可能沒有反應(yīng)，因為它們很快就被轉(zhuǎn)化為無活性的6MMP。因而通過監(jiān)測接受硫嘌呤類藥物治療的病人血紅細胞內(nèi)6MMP和6TGNs的水平，據(jù)此確定準確的用藥劑量，對提高治療效果、減小藥物毒副作用是非常關(guān)鍵的。在本項目的資助下，我們與廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院合作，研究建立了急性淋巴細胞白血病患者紅血球中6MP及其代謝產(chǎn)物的高效液相色譜分析方法，為6MP個性化治療提供基礎(chǔ)。1 實驗1.1 儀器與試劑6巰基嘌呤（6mercaptopurine, 6MP）、6硫鳥嘌呤（6thioguanine, 6TG）、6硫黃嘌呤（6thioxa

5、nthine, 6TX）、6甲基硫嘌呤（6methyl mercaptopurine, 6MMP）、戊醇、乙酸苯汞（phenyl mercury acetate, PMA）和二硫蘇糖醇（DLdithiothreitol, DTT）為Sigma公司產(chǎn)品；甲醇、甲苯為色譜純，其他試劑均為分析純。高效液相色譜儀：島津LC6A，配LC6A高壓輸液泵、柱溫箱、SPD-6AV可變波長紫外可見分光檢測器、系統(tǒng)控制器、CR3A積分儀和色譜工作站。1.2 試劑配制（1）PMA戊醇甲苯溶液的配制：取1.85 mL戊醇，加入1000 mL甲苯中，搖勻，再加入0.5 g PMA，輕輕攪動1 h使PMA溶解，置于暗處保

6、存。此溶液含PMA 1.3 mmol/L，含戊醇170 mmol/L。（2）3.75 mmol/L DTT水溶液配制：取289.2 mg DTT溶于500 mL水中。（3）0.5 mol/L H2SO4。（4）3.4 mol/L NaOH。（5）0.1 mol/L HCl。1.3 標準溶液配制分別取16.8 mg 6TG、16.6 mg 6MMP、17.0 mg 6TX和17.1 mg 6MP溶于水中并定容于100 mL，此溶液為貯備液I，含每種硫嘌呤1.00 mol/mL。取10 mL貯備液I，稀釋至100 mL，為貯備液II，含每種硫嘌呤100 nmol/mL；用貯備液II稀釋成1 nmo

7、l/mL、2 nmol/mL、5 nmol/mL、10 nmol/mL、15 nmol/mL和20 nmol/mL的系列標準溶液備用。1.4 樣品處理（1）血紅細胞制備：采集正在接受硫嘌呤治療的病人全血樣本，肝素鋰抗凝，室溫下1000×g離心10 min，棄去血漿和白血胞，紅細胞以2倍體積的生理鹽水洗滌兩次，最后紅細胞重新懸浮于生理鹽水中，使紅細胞的濃度約為8×108細胞/200L。取少量作紅細胞的準確計數(shù)，其余在20下保存至分析。（2）樣品提?。?00 L血紅細胞（約含8×108紅細胞）加入有800 L 3.75 mmol/L DTT的10 mL螺旋口試管中，再

8、加入500 L 0.5 mol/L的H2SO4，蓋緊，置于100烘箱中水解1 h。在這一步中，硫嘌呤核苷水解轉(zhuǎn)化為相應(yīng)母體硫嘌呤和甲基硫嘌呤，如6TGNs水解生成6TG、6TIMP水解生成6MP、6甲基巰基嘌呤核苷轉(zhuǎn)化為6MMP，硫嘌呤和甲基硫嘌呤可以和乙酸苯汞形成復(fù)合物而被有機溶劑萃取出來。水解物冷卻后，向水解管中加入500 L 3.4 mol/L的NaOH后立即加入6 mL PMA戊醇甲苯溶液，振蕩10 min，離心。吸取5 mL甲苯相于具塞離心試管中，加入200 L 0.1 mol/L HCl，在旋轉(zhuǎn)混合器上混合3×20 s，離心，棄去上層甲苯相，取水相50 L注入色譜儀進行于

9、HPLC分析。1.5 色譜條件色譜柱：C18反相柱。流動相A：0.2%的乙酸水溶液；流動相B：甲醇。梯度洗脫程序：其中016 min為分析梯度，四種物質(zhì)在16min內(nèi)全部出峰，1615 min為洗色譜柱的時間。時間（min）A濃度（）B濃度（）01000162080160100250100251000檢測波長：012.5 min波長為340 nm，檢測6TG、6MP和6TX；12.5 min后切換到290 nm，檢測6MMP。柱溫：40。流速：1.0 mL/min。進樣體積：10 L。2 結(jié)果2.1 色譜圖在上述色譜條件下， 6TG、6MP、 6TX和6MMP混合標準溶液的色譜圖見圖2，四種物

10、質(zhì)出峰的時間依次為9.26、9.96、10.84和15.57 min。從圖2可以看出，色譜分離狀況良好，峰形對稱，四種物質(zhì)均達到基線分離，分離度1.5。圖2. 梯度洗脫分析6MP及其代謝產(chǎn)物的高效液相色譜圖色譜柱：C18；流動相流A：0.2%的醋酸，流動相B：甲醇；梯度：0 min時，100%A， 16 min時， 20%A80%B，檢測器：012.5 min為340 nm， 檢測6TG、6MP、 6TX，12.5 min以后切換為290 nm，檢測6MMP；柱溫：40；流速：1.0 mL/min。進樣量：每種物質(zhì)100 pmol/10 L。保留時間：6TG，9.26 min；6MP 9.96

11、 min，6TX 10.85 min；6MMP，15.57 min。2.2 標準曲線將1 nmol/mL、2 nmol/mL、5 nmol/mL、10 nmol/mL、15 nmol/mL和20 nmol/mL的系列混合標準溶液進樣10 L，得到每種物質(zhì)的峰面積，峰面積對進樣量進行線性擬合，擬合結(jié)果見表1和圖3。本方法對紅血球中10 pmol/8×108 RBC 含量水平的6TG、6MP、 6TX和6MMP可進行準確地檢出和定量分析，滿足臨床應(yīng)用的要求。表1. 6TG、6MP、6TX和6MMP的標準曲線及線性擬合參數(shù)進樣量pmol峰面積6TG6MP6TX6MMP10102388026

12、699612018251732583819865044234032110954639100905182562323294351501409212985337931362120018907166294301619012Y=aX+by=94.5x-130.2y=84.1x-9.4y=213.5x+1077.7y=93.6x+9.3R20.99930.99890.99800.9989圖3. 6TG、6MP、6TX和6MMP的標準曲線2.3 精密度和準確度向未接受硫嘌呤治療的健康人紅血球中加入低、中和高三個濃度的混合標準溶液，然后按照1.4的方法進行處理，按1.5的方法進行色譜分析，平行5份樣品，計算

13、每個標準加入水平下的回收率及其變異系數(shù)，結(jié)果見表2。表2. 6TG、6MP、6TX和6MMP分析的精密度和準確度加入量批內(nèi)（n=5)批間（n=5)(pmol)測得量回收率RSD測得量回收率RSD(pmol)(%)(%)(pmol)(%)(%)平均值±SD平均值±SD6-TG2019.2 ±0.9 96.0 4.7 19.1 ±1.5 95.5 7.9 5048.1 ±2.1 96.2 4.4 47.3 ±4.7 94.6 9.9 200188.1 ±4.6 94.1 2.4 194.4 ±11.3 97.2 5.8

14、 6-MP2019.7 ±0.9 98.5 4.6 19.2 ±1.4 96.0 7.3 5049.3 ±2.2 98.6 4.5 47.9 ±4.1 95.8 8.6 200194.5 ±5.6 97.3 2.9 194.4 ±12.3 97.2 6.3 6-TX2019.4 ±0.7 97.0 3.6 19.0 ±1.4 95.0 7.4 5048.9 ±2.3 97.8 4.7 48.5 ±4.5 97.0 9.3 200195.3 ±7.3 97.7 3.7 190.4

15、77;12.3 95.2 6.5 6-MMP2019.2 ±0.8 96.0 4.2 19.1 ±1.5 95.5 7.9 5049.4 ±2.0 98.8 4.0 47.3 ±4.7 94.6 9.9 200196.3 ±7.6 98.2 3.9 194.4 ±10.4 97.2 5.3 2.4 樣品分析結(jié)果在建立上述能同時分析6TG、6MP、6TX和6MMP等4種物質(zhì)的HPLC方法之前，我們首先建立了前3種物質(zhì)6TG、6MP和6TX的HPLC方法。本方法采用等度洗脫，具體如下：色譜柱：C18；流動相為10：90的甲醇水，含100m

16、mol/L三乙胺并用磷酸調(diào)pH值為3.2，脫氣前加入0.5 mmol/L的DTT；流速：1.0 ml/min；檢測波長：335 nm。色譜圖見圖4。從圖4可以看出，6TG、6MP和6TX在等度洗脫的條件下，在8 min內(nèi)得到了很好的分離。方法的線性、精密度和準確度均滿足要求。但用這個方法，在我們的實驗條件下，6MMP不易出峰。我們用等度洗脫方法，分析了正在接受硫嘌呤藥物治療的ALL患者的49份血樣，典型的色譜圖見圖4B。以正常健康人的血樣為空白對照，其色譜圖見圖4C，分析結(jié)果見表3。ABC圖4. 等度洗脫分析6TG、6MP和6TX的高效液相色譜圖A混合標準，B正在接受硫嘌呤藥物治療的ALL患者

17、血樣，C正常健康人的血樣。色譜柱：C18；流動相為10：90的甲醇水，含100mmol/L三乙胺并用磷酸調(diào)pH值為3.2，脫氣前加入0.5 mmol/L的DTT；流速：1.0 ml/min；檢測波長：335 nm。保留時間：6-TG，4.72 min；6-MP，5.46 min；6-TX，7.17 min。表3. 接受硫嘌呤藥物治療的ALL患者紅血球中6TG、6MP和6TX的等度洗脫高效液相色譜分析結(jié)果（單位：pmol/8×108 RBC）No6-TG6-MP6-TXNo6-TG6-MP6-TX10<10<1027<10<10<1020<10<

18、;10289<10<1030<10<1029193<10<10421<10<10301<10<10<10527<10<1031<1036<1060<10<1032<10<10<1073512<1033<10<10<1080<10<10345<10<10923<10<1035<10<10<101015<10<1036<10<10<10115015<1037<1

19、0<10<1012017<103813813<1039<10<10<10140<10<1040<10<10<1015814<1041<10<10<10160<10<1042<10<10<1017188<104314<10<10185435<1044<10<10<101945<10<10<102046<10<10<102114<10<1047<10<10<10221

20、3<10<104816<10<102321<10<104914<10<10240<10<1050<10<10<102554<1051<10<10<102665<10<10在本項目的研究中，我們先建立了等度洗脫高效液相色譜法，并用此方法分析了一批臨床樣品。由于等度洗脫法6MMP不能很好出峰，我們繼續(xù)對方法進行改進，采用梯度洗脫程序，在優(yōu)化的實驗條件下，在16 min內(nèi)6TG、6MP、6TX和6MMP得到良好的分離，并用向正常健康人血樣中加標的方法進行了精密度和準確度實驗，結(jié)果良好。由

21、于ALL患者血樣不易得到，所以還沒有用梯度洗脫HPLC法分析ALL患者紅血球中6MP及其代謝物的結(jié)果。3 討論由于硫嘌呤類藥物治療ALL等疾病的效果和毒副作用在患者個體之間的差異很大，所以，在治療的過程中監(jiān)測病人體內(nèi)硫嘌呤類藥物的活性代謝學(xué)產(chǎn)物（如6TGNs）和非活性代謝產(chǎn)物（如6MMP），并以次為依據(jù)調(diào)整治療和用藥方案，進行個體化治療，對提高藥物療效、減小毒副作用具有非常主要的意義。Lennard和Singleton2, 3建立了同時測定紅細胞中6TGNs和6MMPNs的HPLC方法，其樣品處理方法是將紅細胞樣品在1.0 mol/L的H2SO4介質(zhì)中于100 下水解1 h，使6TGNs和6M

22、MPNs水解為相應(yīng)的母體硫嘌呤6TG和6MMP，然后在堿性介質(zhì)中用含乙酸苯汞的甲苯溶液將6TG和6MMP萃取到有機相甲苯中，再用0.1 mol/L的HCl將6TG和6MMP反萃到水相中，用于高效液相色譜分析。在樣品水解的過程中加入DTT以防止含硫基團被氧化。PMA萃取的效率與萃取時的pH值密切相關(guān)，堿性越強，萃取效率越高10。Dervieux和Boulieu4, 5的樣品處理方法是在紅血球中加入固體DTT，然后用HClO4沉淀蛋白，離心，提取液于100 下水解45 min，將硫嘌呤核苷水解轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的硫嘌呤，水解液直接用于HPLC分析。Dervieux和Boulieu的研究結(jié)果表明，6MMPN

23、s在酸水解的過程中會轉(zhuǎn)化為4氨基5（甲硫基）羰基咪唑衍生物，轉(zhuǎn)化效率與水解時的pH密切相關(guān)，在硫嘌呤核苷水解轉(zhuǎn)化為硫嘌呤的條件下，6MMPNs的轉(zhuǎn)化率為100。因而在色譜分析時色譜圖上沒有6MMP的色譜峰，而有6MMP衍生物的色譜峰。他們認為本方法不能直接測定6MMP，但可以通過其衍生物間接測定。但Hawatari等6, 7稍作修飾的Dervieux和Boulieu方法卻在色譜圖中得到了6MMP的色譜峰，他們認為水解時6MMP并不能完全轉(zhuǎn)化，因而可以直接測定紅細胞中6MMP的含量。Su等11用100 L血漿，相向中加入25 L 1 mol/L的HCl，旋轉(zhuǎn)混合，置上冷卻，在加入25 L TE緩

24、沖液，旋轉(zhuǎn)混合，置冰上冷卻后離心超濾除去蛋白質(zhì)，取50 L注入液相色譜儀分析。分析時用C18反相柱，梯度洗脫，在40分鐘內(nèi)6MP及其7種代謝產(chǎn)物得到良好分離。這7種代謝物是6TG、6TX、6巰基嘌呤核苷（6mercaptopurine riboside, rMP）、6硫鳥嘌呤核苷（6thioguanosine, rTG）、6硫黃嘌呤核苷（6thioxanthine riboside, rTX）、6MMP和6甲基巰基嘌呤核苷（6methylmercaptopurine riboside, rMMP）。這種處理方法由于不用水解，可以同時測定硫嘌呤和硫嘌呤核苷。Shipkova等8, 9對比研究了L

25、ennard和Singleton方法與Dervieux和Boulieu方法。結(jié)果表明，用Dervieux和Boulieu的方法測得的TGNs的含量是用Lennard和Singleton的方法測得的含量的2.6倍，雖然兩種方法所得到的結(jié)果是顯著相關(guān)的。如果將Lennard和Singleton方法中水解介質(zhì)有H2SO4改為HClO4，則兩種方法的差異減小到1.4倍。Stefan等也報道了近似的結(jié)果9。文獻報道的6MP及其代謝產(chǎn)物的分析結(jié)果相差很大，各實驗室之間的結(jié)果可比性很差，數(shù)據(jù)也無法交流和共享，這主要與樣品處理和提取方法有關(guān)。因此，分析方法的標準化是今后研究工作的重點10。參考文獻1 Cuff

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