慢性馬兜鈴酸腎病大鼠模型腎組織中蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)(1)

1、    慢性馬兜鈴酸腎病大鼠模型腎組織中蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)(1)    】 目的： 制備慢性馬兜鈴酸腎病的大鼠模型，建立馬兜鈴酸腎病大鼠腎組織和正常大鼠腎組織的雙向電泳圖譜，從而展示差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步篩選介導(dǎo)馬兜鈴酸毒性作用的蛋白質(zhì)分子奠定基礎(chǔ). 方法：應(yīng)用馬兜鈴酸腹腔注射制備大鼠慢性馬兜鈴酸腎病模型，提取其腎組織中總蛋白質(zhì)，采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)模型組和正常組腎組織中蛋白質(zhì)進(jìn)行差異展示. 結(jié)果：成功制備了慢性馬兜鈴酸腎病大鼠模型，并建立了模型組和正常組大鼠腎組織的雙向電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)了差異蛋白質(zhì)

2、. 結(jié)論：馬兜鈴酸導(dǎo)致大鼠腎組織中蛋白質(zhì)差異表達(dá)，這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能介導(dǎo)了馬兜鈴酸的毒性作用.【關(guān)鍵詞】 馬兜鈴酸；大鼠；腎組織；雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳；蛋白質(zhì)組【中圖號(hào)】 R587.10引言自Vanhrweghem等1報(bào)道了因減肥藥引起“中草藥腎病（Chinese herbs nephropathy，CHN）”以來(lái)，含馬兜鈴酸成分的中草藥所致的腎損害馬兜鈴酸腎病（aristolochic acid nephropathy，AAN）越來(lái)越受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視. 由于一些常用中草藥及中成藥都含有馬兜鈴酸，因而由馬兜鈴酸引起的腎損害在臨床上十分常見(jiàn)2. 急性AAN主表現(xiàn)為急性腎小管壞死

3、，慢性AAN表現(xiàn)為寡細(xì)胞性腎間質(zhì)纖維化2-3，病情多為不可逆性，而且即使停服藥物，其腎損害仍然繼續(xù)進(jìn)展4-5. 絕大多數(shù)患者很快或逐漸進(jìn)入終末期腎衰，需腎臟替代治療. 因此闡明馬兜鈴酸腎損害的分子機(jī)制，以進(jìn)行早期的診斷和治療（在蛋白質(zhì)或基因水平進(jìn)行干預(yù)和阻斷）將是緩解馬兜鈴酸腎損害的關(guān)鍵. 為此，我們建立慢性馬兜鈴酸腎病模型，用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選和比較馬兜鈴酸誘導(dǎo)的差異蛋白質(zhì)分子，為馬兜鈴酸導(dǎo)致腎損害的分子靶點(diǎn)研究奠定基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料雌性Wistar大鼠，2024 wk齡，體質(zhì)量190210 g（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；馬兜鈴酸制劑：用馬兜鈴酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)生物制品研究所

4、提供）配制成0.5 g/L的溶液,高壓滅菌, 置冰箱4下保存?zhèn)溆? 丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、SDS、三（羥甲基）氨基甲烷、苯甲基磺酰氟（華美生物工程公司）；超純尿素（上海生物工程公司產(chǎn)品）；兩性電解質(zhì)pH 58（上海麗珠東風(fēng)技術(shù)有限公司）；DYY26型雙向電泳槽和梯度混合器（北京六一廠）；電泳儀（BioRad公司）.1.2方法1.2.1慢性馬兜鈴酸腎病動(dòng)物模型的建立根據(jù)文獻(xiàn)6進(jìn)行，將Wistar大鼠隨機(jī)分為2組. 馬兜鈴酸組（n=30）：每只大鼠腹膜內(nèi)注射馬兜鈴酸,劑量為5 mg/(kgd)，共16 wk. 在用藥開(kāi)始后第8，12，16，20，24 wk分別處死6只大鼠. 正常對(duì)照組（n=5

5、）：每只大鼠腹膜內(nèi)注射生理鹽水2 mL/d，共16 wk，在第24 wk實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死. 大鼠在處死時(shí)留取腎臟標(biāo)本，-70冰箱保存，用以作腎臟病理檢查.1.2.2蛋白質(zhì)樣品的準(zhǔn)備在用藥開(kāi)始后第12 wk處死大鼠，取其腎臟，具體方法為：將大鼠乙醚麻醉，開(kāi)腹，分離出鼠雙側(cè)腎臟，自腎動(dòng)脈用冰生理鹽水在體對(duì)腎臟進(jìn)行灌注直至腎臟發(fā)白，取出腎臟用濾紙吸去多余液體，然后用電子天平稱質(zhì)量后，按照比例加入組織裂解液，冰浴上勻漿，靜置，離心，用Lowry法測(cè)定上清液中總蛋白含量，吸取上清液分裝，-70凍存.    1.2.3雙向電泳（2D PAGE）首先進(jìn)行等電聚焦(IEF

6、)：取17 cm IPG膠條(pH 58)在加有樣品的泡漲液中以被動(dòng)式泡漲1216 h，用PROTEAN IEF Cell等點(diǎn)聚焦儀進(jìn)行第一向電泳. IEF結(jié)束后，IPG膠條置含有DTF的平衡液中；然后進(jìn)行SDSPAGE電泳：預(yù)先制備垂直電泳用凝膠，將進(jìn)行完IEF并平衡后的膠條轉(zhuǎn)移至凝膠的上方，用10 g/L熱瓊脂糖溶膠封固. 在PROTEAN II Xi垂直電泳槽的上下槽中加入電極緩沖液后按照預(yù)設(shè)程序進(jìn)行電泳，直至溴酚藍(lán)前沿距下緣0.5 cm時(shí)停止電泳. 最后參照BioRad推薦的硝酸銀染色方法進(jìn)行染色. 凝膠通過(guò)Imagescanner掃描儀以及LabScan掃描軟件進(jìn)行掃描獲取圖像，利用

7、PDQUEST圖像分析軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析，圖像分析包括蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)、編輯、背景扣除和點(diǎn)的匹配等.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析在SPSS 10.0軟件和Excel上進(jìn)行.2結(jié)果2.1慢性馬兜鈴酸腎病模型的鑒定馬兜鈴酸組用藥后8 wk，腎小球、腎小管間質(zhì)、腎血管均未見(jiàn)損害；用藥后12 wk，腎小球未見(jiàn)改變，部分腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生空泡變性；用藥后16 wk，腎臟近曲小管上皮細(xì)胞明顯腫脹，管腔縮小，并伴有部分腎小管上皮細(xì)胞壞死及凋亡；20 wk時(shí)腫脹的小管上皮細(xì)胞逐漸縮小，部分遠(yuǎn)曲小管出現(xiàn)擴(kuò)張，個(gè)別腎小管萎縮，但未見(jiàn)間質(zhì)出現(xiàn)纖維化；24 wk時(shí)可見(jiàn)較多腎小管出現(xiàn)萎縮，腎間質(zhì)出現(xiàn)多灶性纖維化

8、（圖1）.            作者：孫世仁，陳光磊，寧曉暄,陳威 【關(guān)鍵詞】馬兜鈴酸；大鼠；腎組織；雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳；蛋白質(zhì)組Different         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。2.2馬兜鈴酸誘導(dǎo)的大鼠腎組織中蛋白質(zhì)組的

9、差異表達(dá)根據(jù)馬兜鈴酸處理后大鼠不同時(shí)間腎組織病理改變的結(jié)果提示，腎臟于12 wk開(kāi)始出現(xiàn)早期的病變，因此取12 wk時(shí)的腎組織進(jìn)行雙向電泳. 在二維平面上將小鼠腎臟組織蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，得到2D電泳圖譜（圖2），正常對(duì)照組和馬兜鈴酸腎病模型組的匹配率為83.4%，有大量蛋白質(zhì)點(diǎn)相對(duì)含量增加或降低，或新出現(xiàn)，其中87個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在模型組比正常組上調(diào)2倍，18個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)上調(diào)5倍以上，73個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)下調(diào)2倍. 部分表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，其中蛋白質(zhì)點(diǎn)1271，1823和2001在正常組弱表達(dá)，而在模型組高表達(dá)；蛋白質(zhì)點(diǎn)1567和1789在正常組中無(wú)表達(dá)，而在模型組出現(xiàn)表達(dá)；蛋白質(zhì)點(diǎn)1398在模型組中

10、表達(dá)低于正常組.圖1正常對(duì)照組和馬兜鈴酸組大鼠腎組織Masson ×400（略）圖2馬兜鈴酸大鼠腎組織的雙向電泳圖（略）表1正常組和馬兜鈴酸腎病模型組部分差異蛋白質(zhì)點(diǎn)（略）3討論我國(guó)學(xué)者早在1964年就發(fā)現(xiàn)了木通致急性腎衰（ARF）的病例，但由于僅為個(gè)例報(bào)道，無(wú)臨床與病理分析，故未引起重視. 由于一些常用中草藥及中成藥都含有馬兜鈴酸，如關(guān)木通、廣防己、青木香、天仙藤、馬兜鈴、尋骨風(fēng)、朱砂蓮及龍膽瀉肝丸、二十五味松石丸、十香返生丸、大黃清胃丸、小兒金丹片、止咳化痰丸、分清五淋丸、安陽(yáng)精制膏、導(dǎo)赤丸、婦科分清丸、純陽(yáng)正氣丸、冠心蘇合丸、排石顆粒、跌打丸等，因而由馬兜鈴酸引起的腎損害在臨床

11、上十分常見(jiàn). 北京中日友好醫(yī)院報(bào)道，由馬兜鈴酸引起的慢性AAN占其全科慢性腎小管間質(zhì)疾病的80%，此病很可能是我國(guó)最常見(jiàn)的慢性腎小管間質(zhì)疾病2, 目前尚無(wú)有效的治療. 因此，尋找出馬兜鈴酸導(dǎo)致腎臟損害的始動(dòng)分子，進(jìn)而早期診斷和治療（在蛋白質(zhì)或基因水平進(jìn)行干預(yù)和阻斷）將是解決馬兜鈴酸腎損害的關(guān)鍵，也正是我們的研究目標(biāo).差異蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重方面，它是著重于尋找和篩選多個(gè)樣本之間的差異蛋白質(zhì)譜,揭示細(xì)胞生理和病理狀態(tài)的進(jìn)程與本質(zhì)、對(duì)外界環(huán)境刺激的反應(yīng)途徑以及細(xì)胞調(diào)控機(jī)制,同時(shí)獲得對(duì)某些關(guān)鍵蛋白的定性和功能分析，因此差異蛋白質(zhì)組學(xué)為一些疾病的病因?qū)W和治療學(xué)的研究提供了很好的思路. 雙向凝

12、膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)是當(dāng)前分離鑒定蛋白質(zhì)的兩大支柱技術(shù). Kennedy7利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了慶大霉素處理組蛋白質(zhì)所發(fā)生的特異性的變化，結(jié)果得到了一些新的蛋白質(zhì)標(biāo)志物. Aicher等8利用該技術(shù)分析了環(huán)孢菌素A處理后鼠的腎臟，鑒別出一種新的鈣結(jié)合蛋白，而該蛋白可能作為腎臟毒性的一個(gè)新的標(biāo)志物. 差異蛋白質(zhì)組學(xué)的研究同樣也適用于中藥毒性分子靶點(diǎn)的篩選和鑒定. 為此，我們?cè)诮⒙择R兜鈴酸腎病模型的基礎(chǔ)上用雙向電泳技術(shù)篩選和比較模型動(dòng)物腎組織中馬兜鈴酸誘導(dǎo)的差異蛋白質(zhì)分子，為進(jìn)一步尋找馬兜鈴酸導(dǎo)致腎損害的分子靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ).我們利用雙向電泳系統(tǒng)，對(duì)馬兜鈴酸誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化早期（12 wk）大鼠模型

13、的腎組織和正常大鼠腎組織進(jìn)行蛋白差異展示，軟件分析顯示雙向電泳圖譜的匹配率可達(dá)83.4%，同時(shí)出現(xiàn)差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)，提示這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能參與馬兜鈴酸腎損害早期過(guò)程，可能是毒性作用的始動(dòng)分子. 我們還需對(duì)這些差異蛋白質(zhì)分子進(jìn)行質(zhì)譜鑒定及功能研究，才能尋找出真正介導(dǎo)馬兜鈴酸毒性作用的蛋白質(zhì)分子.【參考文獻(xiàn)】1 Vanherweghem JL, Depierreux M, Tielemans C, et al. Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming

14、regimen including Chinese herbsJ. Lancet, 1993,341(8842):387-391.2 陳文, 諶貽璞, 李安, 等. 馬兜鈴酸腎病的臨床與病理表現(xiàn)J. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2001,81(18): 1101-1105.3 陳文, 諶貽璞. 馬兜鈴酸腎病J. 中華內(nèi)科雜志,2001,40:426-427.4 尹廣, 胡偉新, 黎磊石. 木通中毒的腎損害J. 腎臟病與透析腎移植雜志, 1999,8:10-14.5 Strihou C, Vanherweghem JL. The tragic paradigm of Chinese herbs nephropathyJ. Nephrol Dial Transplant,1995,10(2):157-160.6 鄭法雷,張曉明,黃慶元. 慢性馬兜鈴酸腎病動(dòng)物模型的建立及其意義J. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2001,81:1095-1100.7 Kennedy S. Proteomic profiling from human samples: the