大鼠透明質(zhì)酸合成酶3基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及趨化作用研究

1、大鼠透明質(zhì)酸合成酶3基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及趨化作用研究【摘要】 目的: 構(gòu)建透明質(zhì)酸合成酶3（hyaluronan synthase3）真核表達(dá)載體, 轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞并檢測(cè)重組蛋白酶活性。方法: 提取損傷大鼠坐骨神經(jīng)總RNA, RTPCR擴(kuò)增HAS3編碼框cDNA, 構(gòu)建于真核表達(dá)載體pcDNA3.1D中, 并亞克隆到熒光載體pEGFPN1中。將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠施旺細(xì)胞RSC96, 檢測(cè)HAS3的表達(dá)及酶活性。研究轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)巨噬細(xì)胞的趨化作用。結(jié)果: HAS3真核表達(dá)載體pcDNA3.1DHAS3及pEGFPHAS3測(cè)序結(jié)果顯示片段插入正確, 序列與GenBank公布數(shù)據(jù)一致, 轉(zhuǎn)

2、染RSC96細(xì)胞并檢測(cè)到重組蛋白的表達(dá)和酶活性, 過表達(dá)HAS3細(xì)胞的培養(yǎng)上清對(duì)巨噬細(xì)胞的趨化作用顯著高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清。結(jié)論: 成功地構(gòu)建HAS3真核表達(dá)載體且真核表達(dá)的重組HAS3具有合成HA活性, HAS3過表達(dá)培養(yǎng)上清能趨化巨噬細(xì)胞, 在體內(nèi)可能參與到炎癥反應(yīng)中。 【關(guān)鍵詞】 透明質(zhì)酸合成酶 載體構(gòu)建 真核表達(dá) 趨化透明質(zhì)酸（hyaluronic acid, HA）是由葡萄糖醛酸及乙酰氨基葡萄糖二糖單位重復(fù)排列構(gòu)成的不典型的氨基聚糖, 廣泛的分布于各種結(jié)締組織、 皮膚、 軟骨、 滑液中。研究證明HA在體內(nèi)不僅僅是作為細(xì)胞外基質(zhì)參與到組織的結(jié)構(gòu)組成上, 它還是一個(gè)重要的細(xì)胞外信號(hào)分子,

3、在細(xì)胞遷移、 腫瘤、 創(chuàng)傷修復(fù)等方面起重要作用。HA在體內(nèi)由透明質(zhì)酸合成酶（HAS）合成。Itano等1于1996年從1株突變的小鼠乳腺癌細(xì)胞中第1次克隆出哺乳動(dòng)物HAS, 并被命名為mmHAS1。Spicer等2隨后從小鼠胚胎中克隆出第2個(gè)家族成員mmHAS2。1年后該實(shí)驗(yàn)室又成功克隆出HAS家族第3個(gè)成員HAS33。目前普遍認(rèn)為, HAS1與HAS2催化合成大的相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）HA（HMWHA）, 其中HAS1在整個(gè)生命過程中都有表達(dá), 但催化效率不高; HAS2在胚胎發(fā)育時(shí)表達(dá)顯著。HAS3合成小Mr HA（LMWHA）, 是在成年體內(nèi)最為活躍, 參與了多種生理、 病理過程。為研究H

4、AS3及LMWHA的功能及其作用機(jī)制, 我們構(gòu)建了大鼠HAS3真核表達(dá)載體, 通過真核表達(dá)中檢測(cè)酶活性, 并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其對(duì)巨噬細(xì)胞有趨化作用, 為深入研究打下了基礎(chǔ)。1 材料和方法1.1 材料 SD大鼠（雄性, 180200 g）購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心; RSC96細(xì)胞來源于ATCC, 購(gòu)自院上海細(xì)胞庫; TOP10菌種、 pcDNA3.1D、 pEGFPN1質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存; 各種內(nèi)切酶及T4連接酶購(gòu)自TaKaRa公司; KOD Plus 高保真酶、 ReverTra Ace逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自ToYoBo公司; TRIzol、 Lipofectamine2000購(gòu)自Invitroge

5、n公司; DMEM、 胎牛血清購(gòu)自 Gibco公司; 質(zhì)?；厥占癉NA純化試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司; DNA合成及測(cè)序由英駿廣州公司完成。其他化學(xué)試劑均為分析純。1.2 方法1.2.1 大鼠HAS3全長(zhǎng)cDNA的克隆及載體構(gòu)建 根據(jù)GenBank公布的大鼠HAS3 mRNA序列, 通過序列中本身含有的Kpn酶切位點(diǎn)將全長(zhǎng)ORF分5端和3端兩段進(jìn)行擴(kuò)增, 參照pcDNA3.1D多克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn), 共設(shè)計(jì)兩對(duì)擴(kuò)增引物。5端擴(kuò)增上游引物為5GTCAAGCTTCACCATGCCGGTGCAGCTGACTAC3, 含有Hind 酶切位點(diǎn), 下游引物為5CTTCTGATGGTACCAGTCCTC3,

6、含有Kpn酶切位點(diǎn)。3端擴(kuò)增上游引物為5GGAGGACTGGTACCATCAGAAG3, 含有Kpn酶切位點(diǎn), 下游引物為5GTCCTCGAGACCTCAGCAAAAGCCAGGC3, 含有Xho酶切位點(diǎn)。用TRIzol提取CCI大鼠損傷神經(jīng)總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈, 用作PCR的模板。首先用3端片段的引物擴(kuò)增, Tm=60, 共進(jìn)行35個(gè)循環(huán), 切膠回收。用Kpn和Xho雙酶切PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1D質(zhì)粒4 h, 回收酶切產(chǎn)物, 將PCR酶切產(chǎn)物和酶切質(zhì)粒按照101混合, 16連接過夜, 轉(zhuǎn)化TOP10大腸桿菌, 菌落PCR鑒定陽性克隆, 提取重組質(zhì)粒pcDNA3.1DHA

7、S3f3, 酶切鑒定, 測(cè)序。用同樣方法擴(kuò)增HAS3 5端片段, 插入到pcDNA3.1DHAS3f3質(zhì)粒中, 構(gòu)建pcDNA3.1DHAS3重組質(zhì)粒并鑒定。 用Hind 和Sac 雙酶切質(zhì)粒pEGFPN1, 回收, 同樣方法酶切pcDNA3.1DHAS3, 回收1 700 bp左右片段, 將該回收片段與pEGFPN1酶切產(chǎn)物101混合, 16連接過夜, 轉(zhuǎn)化TOP10大腸桿菌, 菌落PCR鑒定陽性克隆, 提取重組質(zhì)粒pEGFPHAS3, 酶切鑒定。1.2.2 HAS3及HAS3GFP融合蛋白的真核表達(dá) RSC96細(xì)胞培養(yǎng)于含有100 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中, 于37、 50

8、mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于轉(zhuǎn)染前24 h按照1108個(gè)/L數(shù)量接種到24孔板中, 轉(zhuǎn)染前換成無雙抗的100 mL/L胎牛血清DMEM培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染方法按照lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染6 h后, 換新鮮100 mL/L胎牛血清 DMEM高糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。收集細(xì)胞, TRIzol提取總RNA和總蛋白, 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈, 用作PCR模板。根據(jù)HAS3 ORF序列, 設(shè)計(jì)檢測(cè)用引物, 上游引物為5TGGCTTCTTTGTGTGGCGTAC3下游引物為5TGTATGACTGTGGCGATGAGG3, 片段大小739 bp。用抗his抗體檢測(cè)總蛋白中HAS

9、3的表達(dá)。熒光顯微鏡下觀察GFP融合蛋白表達(dá)情況。1.2.3 巨噬細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn) 取成年SD大鼠肺, 用PBS灌洗兩肺。灌洗液在4、 1 000 r/min下離心10 min, 用PBS洗滌細(xì)胞團(tuán), 重懸于100 mL/L胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)液中, 調(diào)整細(xì)胞密度至11010個(gè)/L。趨化實(shí)驗(yàn)采用transwell小室, 下室放入RSC96細(xì)胞培養(yǎng)上清。取150 L巨噬細(xì)胞懸液滴于膜上, 37培養(yǎng)90 min, 用棉花輕擦膜上表面, 將膜反向放入另一培養(yǎng)板中, 甲醇固定10 min后, 用吉姆薩染液染色1 h, 流水洗滌, 晾干。鏡下觀察膜上染色細(xì)胞個(gè)數(shù)。2 結(jié)果2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建 pcDN

10、A3.1DHAS3和pEGFPHAS3重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定與理論大小相符（圖1）, 測(cè)序結(jié)果與GenBank中的序列完全一致, 說明目的片段已經(jīng)正確插入到載體上。圖1 重組載體pcDNA3.1DHAS3及pEGFPHAS3的酶切鑒定（略）Fig 1 Restrictive enzyme digestion analysis of recombinant expression vector pcDNA3.1DHAS3 and pEGFPHAS3M: DL 15 000 DNA marker; 1: pcDNA3.1D; 2: pcDNA3.1H3; 3: pEGFPN1; 4: pEGFPH3.1

11、 2.2 HAS3His與HAS3GFP融合蛋白的真核表達(dá) 用pcDNA3.1DHAS3和pEGFPHAS3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RSC96細(xì)胞48 h后, 分別通過RTPCR, Western blot和熒光顯微鏡觀察重組蛋白的表達(dá)情況（圖2、 3）。RTPCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1DHAS3的細(xì)胞有大量HAS3 mRNA的表達(dá), 而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1D空質(zhì)粒的對(duì)照組未檢測(cè)出HAS3mRNA的表達(dá)。Western blot結(jié)果也顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1DHAS3重組質(zhì)粒的細(xì)胞能檢出HisHAS3的表達(dá), 而對(duì)照組未檢出。轉(zhuǎn)染pEGFPHAS3重組質(zhì)粒48 h后, 熒光觀測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況,

12、可觀察到帶有明顯綠色熒光的細(xì)胞, 并且熒光主要分布于細(xì)胞膜上。轉(zhuǎn)染pEGFPN1的對(duì)照組也可觀察到細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光, 但熒光分布于整個(gè)細(xì)胞基質(zhì), 說明HAS3GFP融合蛋白能夠定位于細(xì)胞膜上, 從而可能具備酶活性。2.3 巨噬細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)了過表達(dá)HAS3細(xì)胞的培養(yǎng)上清對(duì)巨噬細(xì)胞的趨化活性（圖4）。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組處理的巨噬細(xì)胞的穿膜能力高于對(duì)照組, 暗示LWAHA可能參與到炎癥反應(yīng)的過程中。圖2 HAS3His融合蛋白在RSC96細(xì)胞中的表達(dá)（略）Fig 2 Expression of HAS3His fusion protein in RSC96 cellsA: RTPCR analys

13、is of mRNA level of HAS3; B: Western blot analysis of HAS3 expression. WT: Wild type; 1: pcDNA3.1; 2: pcDNA3.1DHAS3.圖3 HAS3GFP融合蛋白在RSC96細(xì)胞中的表達(dá)（略）Fig 3 Expression of HAS3GFP fusion protein in RSC96 cellsA: pEGFPN1; B: pEGFPHAS3.圖4 HAS3過表達(dá)培養(yǎng)上清對(duì)巨噬細(xì)胞穿膜能力的影響（略）Fig 4 Effects of condition medium of HAS3 ov

14、erexpression RSC96 cells on chemotaxis of macrophages3 討論 HA的作用與其 Mr的大小有關(guān)。Mr在200 000左右的LMWHA能夠激活核轉(zhuǎn)錄因子NFB, Mr大于6106的HMWHA卻起抑制作用。 Fieber等4的研究也發(fā)現(xiàn), LMWHA能夠促進(jìn)MEFs和3LL細(xì)胞MMP13和MMP9的表達(dá), 而HMWHA卻沒有明顯作用。此外, HAS3和LMWHA還參與到損傷后炎癥過程中。Bai等5用HAS3敲除的小鼠研究了小Mr HA在肺損傷中的作用, 發(fā)現(xiàn)野生型小鼠在損傷后有明顯的白細(xì)胞浸潤(rùn), MIP2和HAS3的表達(dá)提高, 而HAS3敲除鼠沒

15、有這種表現(xiàn), 進(jìn)一步證明了HAS3及LMWHA在肺損傷后的炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。目前的研究表明, LMWHA似乎更多的參與到損傷及損傷后的炎癥反應(yīng)中, 其機(jī)制需要進(jìn)一步研究。 我們?cè)谏窠?jīng)損傷及神經(jīng)源性慢性疼痛的研究中也發(fā)現(xiàn), HA的積累和HAS表達(dá)的上調(diào)可能參與到神經(jīng)損傷和疼痛發(fā)生中, 因此克隆了大鼠HAS3全長(zhǎng), 進(jìn)一步研究LMWHA在損傷和炎癥中的作用機(jī)制。根據(jù)已有的研究結(jié)果, 我們?cè)趽p傷神經(jīng)中檢測(cè)到HAS3表達(dá), 從cDNA中克隆HAS3全長(zhǎng)。最初直接通過PCR擴(kuò)增HAS3 全長(zhǎng)未能擴(kuò)出條帶, 根據(jù)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), HAS3 ORF在HAS3 cDNA的位置為1721836, 考慮到逆

16、轉(zhuǎn)錄過程中, cDNA可能形成的結(jié)構(gòu)、 5端的完整性以及長(zhǎng)片段高保真酶反應(yīng)效率, 我們利用HAS3 ORF中的Kpn 酶切位點(diǎn)將HAS3全長(zhǎng)分為兩段分別擴(kuò)增, 連接到pcDNA3.1D載體上。結(jié)果表明, 相同條件下3端片段擴(kuò)增后產(chǎn)物濃度明顯大于5端片段, 說明在最初進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增時(shí)確實(shí)在5端位置遇到障礙, 導(dǎo)致無法直接擴(kuò)出全長(zhǎng)。我們先后將兩片段連接到載體后測(cè)序表明片段插入正確, 序列與GenBank公布數(shù)據(jù)一致。我們用pcDNA3.1DHA3轉(zhuǎn)染RSC96細(xì)胞, 48 h后通過RTPCR和Western blot檢測(cè)HAS3表達(dá), 結(jié)果野生型和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞均未檢測(cè)出HAS3的表達(dá), 而轉(zhuǎn)染p

17、cDNA3.1DHAS3的細(xì)胞檢測(cè)出明顯的表達(dá)。然后我們通過轉(zhuǎn)染pEGFPHAS3檢測(cè)GFPHAS3融合蛋白的表達(dá), 對(duì)重組HAS3進(jìn)行定位。與轉(zhuǎn)染pEGFPN1的空載體相比GFPHAS3融合蛋白明顯多分布與細(xì)胞膜上。 在隨后的實(shí)驗(yàn)中, 我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HAS3細(xì)胞的培養(yǎng)上清對(duì)巨噬細(xì)胞具有明顯的趨化作用, 也表明在機(jī)體損傷后HAS3表達(dá)和LMWHA合成的增加可能參與到炎癥反應(yīng)中。從目前報(bào)道看, HA對(duì)細(xì)胞的趨化過程至少有兩種可能的途徑。一是細(xì)胞對(duì)HA分子本身的趨向性, Tzircotis等6報(bào)道部分細(xì)胞如MDAMB468和MDAMB231乳腺癌細(xì)胞能夠在CD44介導(dǎo)下從低濃度HA環(huán)境趨向高濃度H

18、A環(huán)境, 而NIH3T3細(xì)胞則沒有這種行為。另一方面, LMWHA能夠誘導(dǎo)一些細(xì)胞因子的表達(dá), 如IL8, MCP, MIP2等, 趨化炎癥細(xì)胞向炎癥位點(diǎn)浸潤(rùn)。 總之, 研究HAS的表達(dá)調(diào)控、 活性變化對(duì)于闡明HA合成機(jī)制和功能至關(guān)重要。我們克隆出大鼠HAS3基因, 并通過真核表達(dá)檢測(cè)了其活性, 有利于深入研究生理或病理過程中HAS3及HA調(diào)控的功能機(jī)制?！尽?1 Itano N, Kimata K. Expression cloning and molecular characterization of HAS protein, a eukaryotic hyaluronan synthaseJ. J Biol Chem, 1996, 271(17): 9875-9878.2 Spicer AP, Augustine ML, McDonald JA. Molecular cloning and characterization of a putative mouse hyaluronan synthaseJ. J Biol Chem, 1996, 271(38): 23400-2