MYL1基因mRNA選擇性剪切體的鑒定及其在不同發(fā)育時期的藍塘與長白豬骨骼肌中的

1、12廣東農(nóng)業(yè)科學2010年第1期MYL1基因mRNA選擇性剪切體的鑒定及其在不同發(fā)育時期的藍塘與長白豬骨骼肌中的表達凌飛1，方偉2，杜紅麗1，陳瑤生2（1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510006；2.中山大學生命科學學院，廣東廣州510006）摘要：肌球蛋白輕鏈1基因（MYL1）的2個剪切體MLC1f及MLC3f在骨骼肌不同發(fā)育時期中發(fā)揮著重要作用。為進一步了解MYL1基因在豬骨骼肌發(fā)育過程中的重要作用，通過電子克隆、RT-PCR擴增及實時定量PCR方法克隆和鑒定了豬MYL1基因mRNA5個選擇性剪切體（MLC1f、MLC3f、MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C）。其

2、中MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C是在豬背最長肌中鑒定到的MYL1基因的3個新轉(zhuǎn)錄本，目前在人、鼠等其它物種尚無這三種轉(zhuǎn)錄本的報道。結(jié)果表明，剪切體MLC3f在180日齡長白豬中的表達量最高，而剪切體MLC1f則是在90日齡藍塘豬的表達量最高；剪切體MLC5f-A在藍塘與長白豬中各發(fā)育時期的表達量都很低；除了剪切體MLC1f外，其余轉(zhuǎn)錄本的表達量均為隨個體體重的增加而逐步增加。通過對MYL1基因不同選擇性剪切體的鑒定，為其在骨骼肌不同發(fā)育階段或組織類型特異性表達調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)，為該基因功能的研究提供重要線索。關(guān)鍵詞：豬肌球蛋白輕鏈1基因；選擇性剪接體；RT-PCR；Real-

3、timePCR中圖分類號：S828文獻標識碼：A文章編號：1004-874X（2010）01-0012-06IdentificationoftranscriptsfromtheporcineMYL1geneanditsexpressiononthedevelopmentofskeletonmuscleinLanTangandLandracepigLINGFei1,FANGWei2,DUHong-Li1,CHENYao-Sheng2（1.SchoolofBioscienceandBioengineering,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou51

4、0640,China；2.SchoolofLifeScience,SunYat-SenUniversity,Guangzhou510006,China）Abstract:Thefastskeletalalkalimyosinlightpolypeptide1(MYL1)geneencodestwoisoforms,1fand3fplayedakeyroleduringskeletalmuscledevelopment.TounderstandtheregulationofMYL1geneexpressioninpig,MLC1f,MLC3fandthreeadditionalisoforms(

5、MLC5f-A,-B,-C)ofporcineMYL1wereidentifiedbyreversetranscriptase-PCRandreal-timePCR,ofwhichMLC5fshadnotbeenreportedinhumanandmouseasyet.TheresultssuggestedthatexpressionofMLC3fwasthehighestat180daysinLandracepigs,andexpressionofMLC1fwasthehighestat90daysinLanTangpigs.ExpressionsofMLC5f-Awerelowbothin

6、LanTangpigsandLandracepigsduringtheirindividualdevelopment.ExceptMLC1f,expressionofothertranscriptssteadilyincreasedalongwithincreaseofindividualbodyweights.TheirexpressioninindividualdevelopmentandidentificationofisformsfromtheporcineMYL1geneprovidesimportantmoleculargeneticknowledgeconcerningthisg

7、ene.Keywords:MYL1;alternativesplicing;RT-PCR;Real-timePCR可變剪接是真核細胞的一種重要的mRNA轉(zhuǎn)錄后加工機制，由此而產(chǎn)生多種相應(yīng)的mRNA轉(zhuǎn)錄本（transcripts）或異構(gòu)體(isoform)，使1個基因可以翻譯收稿日期：2009-10-21基金項目：科技部“973”項目（2006CB102101）作者簡介：凌飛（1972-），女，博士，講師，E-mail：505569452為多種多肽序列，是基因表達多樣性的重要表現(xiàn)形式。通過大量的EST數(shù)據(jù)以及最近所獲得的微陣列數(shù)據(jù)，對人類基因組的分析表明，目前80%的基因在表達過程中可通過選擇性

8、剪切，產(chǎn)生多種形式的mRNA，有的基因甚至能夠產(chǎn)生幾萬種不同形式的mRNA。選擇性剪切在細胞信號傳導(dǎo)、發(fā)育階段與組織類型特異性調(diào)控中起著重要作用。因此，研究基因的選擇性剪切對了解基因功能有重要意義。肌球蛋白是肌纖維的主要組成成分之一，是一種通訊作者：陳瑤生（1962-），男，博士，教授，E-mail：chyaoshe13多功能的馬達蛋白，為肌肉收縮提供動力。肌球蛋白是一個超級家族，由2條重鏈（MyosinHeavyChain，前）、90、150和180日齡屠宰測定的同時對同窩全部豬只進行生產(chǎn)性能的測定。在1、27（斷奶前）、90、150、180日齡，每品種選取體重接近平均體重的試驗豬各6頭（公

9、母各3頭），稱重后頸靜脈采血，屠宰，取肝臟、脂肪和肌肉樣，迅速保存到液氮中。宰前絕食12h，僅供飲水。MHC）和2條輕鏈組成（MyosinLightChain，MLC），其中輕鏈由必需輕鏈（AlkaliLightChain，ELC）與調(diào)節(jié)輕鏈（RegulatoryLightChain，RLC）組成。動物個體在不同的生長時期生理需求、選擇性剪接和其他轉(zhuǎn)錄后加工等機制作用下，肌球蛋白輕鏈和重鏈是以不同的異構(gòu)體形式存在于肌肉中。在成年哺乳動物的骨骼肌中，肌球蛋白必需輕鏈主要是由2個快肌型異構(gòu)體（MLC1f、MLC3f）和1個慢肌型異構(gòu)體（MLC-1s/v）組成。在脊椎動物的心肌、平滑肌和其它背肌的快

10、肌纖維中主要存在肌球蛋白輕鏈1基因（fastskeletalmyosinlightpolypeptide1,MYL1)的MLC1f和MLC3f2種異構(gòu)體1-2，這2種異構(gòu)體分別包含第1、4、59外顯子和第2、3、59外顯子，兩者之間的不同僅在于N-末端的1.21.2.1試驗方法生物信息學分析利用GenBank數(shù)據(jù)庫的Blast檢索，搜索nr數(shù)據(jù)庫和EST數(shù)據(jù)庫，得到MYL1基因全長cDNA序列后，再以該cDNA序列在NCBI網(wǎng)站的BLAST程序中搜索人高通量基因組序列數(shù)據(jù)庫（HTG），通過比對得到cDNA序列與相應(yīng)的人基因組序列，結(jié)合GU-AG剪切方式對豬MYL1基因的內(nèi)含子、外顯子邊界進行分

11、析、確定。1.2.2基因組DNA及各組織總RNA的提取參考上海生工生物工程有限公司的基因組DNA提取試劑盒方法，自配試劑，抽提豬耳組織基因組DNA。嚴格按照TIANGENTissue總RNA提取試劑盒的使用說明書，抽提豬背最長肌組織中的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成41個氨基酸3-7。骨骼肌中的MLC1f和MLC3f異構(gòu)體出現(xiàn)在胚胎形成的不同時期中：在小鼠中，MLC1f轉(zhuǎn)錄體是從胚胎骨骼肌的分化時期（E9）開始積累，而MLC3f轉(zhuǎn)錄體從胚胎骨骼肌E13.5E15時期開始大量積累8-9。在小鼠的胚胎肌肉發(fā)育階段，MLC1f、MLC3f表達方式是相互獨立的，即在胚胎發(fā)育不同時期出現(xiàn)1。骨骼肌及其不同肌纖維的發(fā)

12、育在豬肉質(zhì)研究中起著至關(guān)重要的作用。Fontanesi等10將MYL1基因定位于豬15號染色體上，發(fā)現(xiàn)在豬骨骼肌中MYL1基因主要有2種選擇性剪接體（MLC1f、MLC3f）。本課題組在構(gòu)建藍塘豬背最長肌組織cDNA噬菌體文庫時發(fā)現(xiàn)至少存在5種MYL1mRNA轉(zhuǎn)錄本(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。為了證實我們的猜測，本文通過電子克隆、RT-PCR擴增及Real-cDNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?.2.3RT-PCR以1.2.2中進過驗證的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，根據(jù)各剪切體可能存在的特殊位置，分別以不同選擇性剪接體特異引物進行RT-PCR擴增，鑒定選擇性剪切體的存在（引物見表1）。PCR反應(yīng)體積以及擴增條

13、件依據(jù)PCRTaqMix（廣州盈信公司）使用說明書進行。1.2.4實時熒光定量PCR本試驗采用SYBRGreenRealtimePCRMix（Takara）的方法。用于檢測MYL1基因各mRNA轉(zhuǎn)錄本表達的熒光定量PCR的引物見表timePCR方法，鑒定和分析了豬MYL1基因mRNA5個選擇性剪切體（MLC1f、MLC3f、MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C）及其在不同發(fā)育時期的藍塘與長白豬骨骼肌的表達。對MYL1基因各種選擇性剪接體的鑒定，以期為深入了解和闡明該基因的表達調(diào)控研究提供重要的依據(jù)。2，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。分別以不同個體肌肉組織的cDNA樣為模板，

14、每個樣品用特定引物擴增，3次重復(fù)；同時采用-actin作為陽性對照，3次重復(fù)。反應(yīng)體系、反應(yīng)程序詳見產(chǎn)品說明書。具體操作步驟詳見Takara公司提供的本試劑盒說明書。數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計采用Ct法來度量長白豬和藍塘豬肌肉表達的發(fā)育性變化。具體做法是將每個樣品的11.1材料與方法試驗材料各mRNA選擇性剪切體的RT-PCR鑒定所用的Ct平均值減去對應(yīng)樣品的-actin平均Ct值得到各個組織的Ct值，即Ct=樣品目的基因Ct均值-樣品-actinCt均值，最后用公式2-Ct計算。cDNA均來自廣東省板嶺原種豬場純種藍塘豬耳組織和背最長肌的組織樣品，采集的個體均為達到體成熟的健康豬。2.1結(jié)果與分析MYL1

15、基因結(jié)構(gòu)分析（外顯子與內(nèi)含子邊界的確通過Blast檢索GenBank數(shù)據(jù)庫中的nr數(shù)據(jù)庫和Real-timePCR試驗選用廣東省東莞市板嶺原種豬場同期懷孕的6頭藍塘母豬和6頭長白母豬所產(chǎn)仔豬定）及cDNA序列的獲得36頭。飼養(yǎng)試驗期為從初生至180日齡。在1、27（斷奶14表1各選擇性剪切體鑒定引物名稱引物序列產(chǎn)物MLC1fMLC3fMLC5f-AMLC5f-BMLC5f-CMLC5V-actinF：5'GCTCCTCTTTTAACCCATCCTTTG3'(exon1)R：5'GTGGTGCTTGGATTTGAGATTGTC3'（exon9）F：5'GC

16、CCTCAACTCACTCTTCAGCTTC3'(exon2)R：5'AGTGGTGCTTGGATTTGAGATTGT3'(exon9)F：5'TCAGCCCTCAACTCACTCTT3'(exon2)R：5'CATCCTGCTGTTCCTTAGAGA3'(exon4)F：5'CCAGATTGCTGAACAGGCGAAT3'（exon3-5）R：5'TGGTGCTTGGATTTGAGATTGT3'（exon9）F：5'CCAGATTGCTGGCGAATGCAAG3'（exon3-5）R：5&

17、#39;GTGGTGCTTGGATTTGAGATTGTC3'（exon9）F：5'GCCCAGCAGTTTCATCATGTCC3'（exon2-exon3）R：5'GCTTCCCTGGTCCTTGTTGTTG3'(exon5-exon6)F：5'ATGTACGTGGCCATCCAGGC3'R：5'CGTAGCACAGCTTCTCCTTGAT3'表2各選擇性剪切體實時定量PCR引物860bp760bp110bp659bp654bp4個產(chǎn)物（268、296、237、232bp）262bp轉(zhuǎn)錄本名稱引物產(chǎn)物大小MLC1fMLC3

18、fMLC5f-AMLC5f-CF:R:F:R:F:R:F:R:5'-GCCCCACCCAAAGAAGAAAA-3'(exon1)5'-GCCCGAAGGACATCACCAAC-3'(exon5)5'-GGATCAGCCCTCAACTCACTCT-3'(exon2)5'-CTCCTTGAATTCAGCAATCTGG-3'(exon3-5)5'-AGCCCTCAACTCACTCTTCAG-3'(exon2)5'-CATCCTGCTGTTCCTTAGAGA-3'(exon4)5'-CAGATTGC

19、TGGCGAATGCAA-3'(exon3-5)5'-TCCCTGGTCCTTGTTGTTGG-3'(exon5-6pbpbpbpEST數(shù)據(jù)庫，得到MYL1基因全長cDNA序列（DQ629158、NM214374、DY843587），然后以獲得的31bp，不同的是這2條EST（BX668300、DQ629161）都比MLC3f3端少了234bp，而序列（AY864616）3端與cDNA序列在NCBI網(wǎng)站的BLAST程序中搜索人高通量基因組序列數(shù)據(jù)庫（HTG），通過比對得到cDNA序列與相應(yīng)的人基因組序列（AC097525），并結(jié)合GU-MLC3

20、f3端相同。從初步分析結(jié)果來看，推測MYL1基因可能至少存在5種選擇性剪接體。2.2AG剪切方式對豬MYL1基因的內(nèi)含子、外顯子邊界進行分析，初步推測出MYL1基因的外顯子與內(nèi)含子的連接區(qū)，參考其他物種的基因結(jié)構(gòu)后，確定MYL1基因是由9個外顯子與8個內(nèi)含子組成。分析發(fā)現(xiàn)，豬MYL1基因常見的選擇性剪接體RT-PCR擴增結(jié)果為了確認MYL1基因可能存在的多種選擇性剪接體，本研究采用豬背最長肌組織總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以MLC1f、MLC3f、MLC5f-A和MLC5V特異引物進行RT-PCR擴增。MLC1f引物得到大約為860bp的特異擴增產(chǎn)物；MLC3f引物得到大約為760bp的特異

21、擴增產(chǎn)物；MLC1f、MLC3f產(chǎn)物克隆測序得到序列長度分別為865bp和762bp（圖1）。MLC1f克隆測序序列包含了第1、4和59外顯子在內(nèi)的CDS序列，與已報道的MLC1fcDNA同源性達到100；MLC3f克隆測序序列包含了第2、3和59外顯子在內(nèi)的CDS序列，同源性也達到MLC3f存在6條豬EST（NM214374、DY843587、CF359232、EB684323、EB424025、DY419197）；選擇性剪接體MLC1f存在5條豬EST（DQ629158、DN109784、DN119281、DR083367、DY417097）。同時發(fā)現(xiàn)至少存在兩種以上新的選擇性剪接體，其中

22、這2條EST（BX666768、BX672580）和另一條EST（DQ629160）都在MLC3f的第90到100個堿基處插入了28bp，而且3端比MLC3f少了234bp，另外3條EST（AY864616、BX668300、DQ629161）在MLC3f的同一位置都缺失了100。引物MLC5f擴增后得到大約為110bp的特異擴增產(chǎn)物（圖1）；經(jīng)克隆測序和序列分析后，確定該序列長112bp，包含了第2、3、4外顯子。用MLC5V引物15進行RT-PCR擴增，由于擴增產(chǎn)物中部分產(chǎn)物的表達量很低，瓊脂糖凝膠電泳無法看到多條特異帶。經(jīng)擴增產(chǎn)物經(jīng)12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，可得大小和亮度不一致

23、的3條特異擴增產(chǎn)物（圖2）。MLC5V產(chǎn)物回收純化、進行轉(zhuǎn)化克隆，在5個培養(yǎng)平板上隨機挑取大約200個菌落進行培養(yǎng)，進行菌液PCR鑒定，經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，最后選符合預(yù)期長度的樣品進行測序。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4種存在差異的序列（MLC5f-A，MLC3f，MLC5f-B和MLC5f-C），而這4種存在差異的序列占總挑取菌比例分別是1.5%、81.5%、配；而MLC5f-B和MLC5f-C序列長度分別為237bp和232bp，與前面得到cDNA序列（AY864616、BX668300、DQ629161）相匹配，它們都和MLC3f序列一樣出現(xiàn)外顯子4缺失，只包含了第3外顯子和第5外顯子部分序列

24、，即在外顯子5序列的開始端分別出現(xiàn)缺失了31bp和36bp。另外，剪接位點分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們都符合GT/AG規(guī)則，并且共同的隱含剪接結(jié)合位點都是AG。為了進一步確認MLC5f-B與MLC5f-C剪切體的存在，針對MLC5f-B（外顯子5的5端缺31bp）與1%、0.5%。經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)物有4種剪接形式（圖3）。圖3中MLC3f序列長度為268bp，包含了第3、5外顯子序列，與已報道的常見MLC3f序列相匹配；而MLC5f-C（外顯子5的5端缺36bp）剪切體的可能結(jié)構(gòu)，本研究分別設(shè)計了2對引物。MLC5f-B與MLC5f-C作為特異性引物用于MLC5f-B與MLC5f-C這2個轉(zhuǎn)錄本的鑒定。

25、通過RT-PCR擴增，MLC5f-B和MLC5f-A序列長296bp，包含了第3、4、5外顯子序列，比MLC3f序列多了28bp的外顯子4序列，同時也和前面得到cDNA序列（BX666768、DQ629160）相匹MLC5f-C引物分別得到659bp和654bp的特異擴增產(chǎn)物（圖1）。從左到右依次為MLC1f、MLC3f、MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C，Lane1分別是各剪切體的PCR特異性產(chǎn)物，Lane2是maker。圖1MYL1各剪切體RT-PCR電泳結(jié)果。圖2MLC5V的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果圖3MLC5V引物RT-PCR產(chǎn)物克隆測序得到的差異序列2.3MYL1基因

26、各mRNA轉(zhuǎn)錄本在不同發(fā)育時期藍塘從各剪切體在藍塘與長白豬骨骼肌不同發(fā)育時期的表達量（表3）的結(jié)果可以看出以下幾個規(guī)律：（1）與長白豬骨骼肌中的表達結(jié)果MYL1基因各選擇性剪切體在同一豬種同一時期的表達量差異很大；（2）在成年長白豬中，MLC3f剪切體的16表達量是最高的，該剪切體可能是MYL1基因的主要轉(zhuǎn)錄形式；（3）MLC5f-A這種剪切體在藍塘與長白豬中各發(fā)育時期的表達量很低；（4）在90日齡的藍塘豬中，MLC1f剪切體的表達量較高；（5）除了MLC3f剪切體在90日齡的藍塘豬及27日齡的長白豬表達量就達到最高外，其余轉(zhuǎn)錄本的表達量都是隨著個體體重的增加而逐步增加，到成年時表達量是迅速增

27、到最高。表3各剪切體在藍塘與長白豬骨骼肌不同發(fā)育時期的表達量（平均值±標準誤差）日齡品種基），前者與GenBank數(shù)據(jù)庫cDNA序列（AY864616、DQ629161）一樣都出現(xiàn)外顯子4缺失，只包含了第3外顯子和第5外顯子部分序列，即在外顯子5的開始端分別出現(xiàn)31bp的缺失，即MLC5f-B轉(zhuǎn)錄本整個序列包含了第2、3、6、7、8外顯子、第5外顯子3端113個堿基以及第9外顯子前端107個堿基。最后一種序列為首次發(fā)現(xiàn)，它同樣出現(xiàn)外顯子4缺失，只包含了第3外顯子和第5外顯子部分序列，但在外顯子5序列的開始端出現(xiàn)36bp的缺失，比前者多缺失5個堿基，和MLC1f、MLC3f有共同的終止

28、信號polyA，整個序列MLC5f-CMLC1fMLC3fMLC5f-A包含了第2、3、6、7、8、9外顯子和第5外顯子3端113個堿基。本研究將這個新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本暫命名為12790藍塘（LT）16.59±0.137.84±0.140.02±0.00長白（LD）藍塘（LT）長白（LD）藍塘（LT）長白（LD）180藍塘（LT）長白（）1.82±0.144.68±0.092.77±0.040.02±0.001.22±0.0120.06±0.5320.1±0.140.12±0.014.44

29、±0.6423.62±0.4810.7±0.350.03±0.016.51±0.0769.98±6.0842.6±0.850.12±0.0015.86±1.440.76±0.0619.4±0.270.10±0.055.34±0.489.25±2.3157.25±6.320.16±0.0120.39±3.001.52±0.01528.9±18.190.36±0.01195.17±12.26

30、MLC5f-C。對本研究鑒定的幾種選擇性剪接體的剪接形式分析發(fā)現(xiàn)，它們主要有以下幾種剪接類型：（1）出現(xiàn)常見的外顯子跳躍。如MLC1f出現(xiàn)第2、第3外顯子跳躍，而MLC3f和其它選擇剪接體出現(xiàn)第4外顯子跳躍。（2）相鄰的外顯子相互排斥。如MLC1f和MLC3f兩者之間的出現(xiàn)第3和第4外顯子相互排斥。（3）選擇3'端的剪接位點允許個別外顯子或縮短。如幾種選擇剪接體都選擇不同的3'端的剪接位點，即在第5外顯子前端不同位點進行剪切，使得外顯子5序列縮短。（4）選擇不同的轉(zhuǎn)錄起始位點形成不同的選擇性剪接體。如MLC1f從第1外顯子開始轉(zhuǎn)錄，而其它選擇剪接體從第2外顯子開始轉(zhuǎn)錄。（5）選

31、擇不同的poly（A）位點形成不同的選擇性剪接體。如MLC1f、MLC3f、3結(jié)論與討論本研究通過RT-PCR擴增及實時定量PCR方法克隆和鑒定了豬MYL1基因mRNA5個選擇性剪切體（MLC1f、MLC3f、MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C）。將這些轉(zhuǎn)錄本與GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性比較發(fā)現(xiàn)，我們在豬背最長肌中鑒定到豬MYL1基因3個新的轉(zhuǎn)錄本：MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C。各轉(zhuǎn)錄本都能在GenBank數(shù)據(jù)庫中找到相應(yīng)的mRNA序列或MLC5f-B和MLC5f-C都選擇在外顯子9后端出現(xiàn)poly（A）位點，而MLC5f-A選擇在外顯子9前端107堿基處出現(xiàn)

32、poly（A）位點。對豬MYL1基因的選擇性剪接體蛋白序列與人類、黃牛、家兔、黑猩猩、大家鼠、小家鼠、雞等十幾個物種的選擇性剪接體蛋白序列進行同源性比較發(fā)現(xiàn)，在物種間MYL1基因的MLC1f、MLC3f選擇性剪接體蛋白序列同源性很高，特別是哺乳動物間蛋白序列高度同源，推測它們之間也具有相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。而EST。其中，MLC1fcDNA序列包含了第1、4和5、6、7、8、9外顯子，即MYL1基因前mRNA出現(xiàn)第2和第3外顯子跳躍后形成的剪接體。剪切體MLC3fcDNA序列包含了第2、3和5、6、7、8、9外顯子，即MYL1基因前mRNA選擇第2外顯子為開始轉(zhuǎn)錄起點和出現(xiàn)第4外顯子跳躍后形成的剪

33、接體。剪切體MLC5f-A序列除了比MLC3f多28bp的外顯子序列外，在外顯子9的前端的107堿基處出現(xiàn)提前終止信號polyA，整個序列包含了第2、3、4、5、6、7、8外顯子和第9外顯子前端MLC5f-A、MLC5f-B及MLC5f-C編碼蛋白序列在其它物種沒有找到相關(guān)的同源蛋白序列，這可能是因為其它物種目前還沒有發(fā)現(xiàn)這幾種選擇性剪接體或是在其它的物種中沒有存在這幾種選擇性剪接體。對豬107個堿基。此外，本研究采用生物信息學方法初步分析發(fā)現(xiàn)選擇性剪接區(qū)域是在第35外顯子之間，通過設(shè)計特異引物進行RT-PCR擴增，克隆得到4種差異序列。經(jīng)序列比對后發(fā)現(xiàn)，其中一序列為MLC3f序列，它包含了第

34、3、5外顯子序列；另一序列為MLC5f-A序列則包含第3、4、5外顯子；另外2個差異序列長度分別為237bp和232bp（兩者僅在外顯子5上相差5個堿MLC1f蛋白序列進行功能位點分析發(fā)現(xiàn)其編碼氨基酸殘基包含3個結(jié)合鈣蛋白質(zhì)功能域，MLC3f蛋白的編碼氨基酸殘基中也包含3個結(jié)合鈣蛋白質(zhì)功能域，而MLC5f-A、MLC5f-B及MLC5f-C蛋白的編碼氨基酸殘基只包含2個結(jié)合鈣蛋白質(zhì)功能域。通過此結(jié)果，推測17MYL1基因與鈣離子結(jié)合密切相關(guān)，是一種鈣結(jié)合蛋白。同時，發(fā)現(xiàn)MLC1f和MLC3f蛋白比其他幾種選擇性剪接體編碼蛋白多一個結(jié)合鈣蛋白質(zhì)功能域，這種差異結(jié)合鈣蛋白質(zhì)功能域有可能影響到它們之

35、間的蛋白表達水平和蛋白功能出現(xiàn)差異，需要在蛋白水平上進一步證實和深入研究。多個MYL1轉(zhuǎn)錄變異體的存在揭示了該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的復(fù)雜性和其功能重要性，復(fù)雜的調(diào)控機制確保了該基因的表達水平及其相應(yīng)的生物學功能得以在生物體內(nèi)得到精確的調(diào)控。分析發(fā)現(xiàn)，MLC1f和543PhysiologicalReviews,1996,76:371-423.PeriasamyM,StrehlerE,Garfinkel,etal.Fastskeletalmusclemyosinlightchains1and3areproducedfromasinglegenebyacombinedprocessofdifferent

36、ialRNAtranscriptionandsplicingJ.JBiolChem,1984,259:13595-13604.RobertB,DaubasP,Akimenko,etal.Asinglelocusinthemouseencodesbothmyosinlightchains1and3,asecondlocuscorrespondstoarelatedpseudogeneJ.Cell,1984,39:129-140.NabeshimaY,Fujii-KuriyamaY,MuramatsuM,etal.Alternativetranscriptionandtwomodesofsplic

37、ingresultintwomyosinlightchainsfromonegeneJ.Nature,1984,308:333-338.6HollandLZ,PaceDA,BlinkML,etal.Sequenceandexpressionofamphioxusalkalimyosinlightchain（AmphiMLC-alk）throughoutdevelopment:implicationsforMLC3f蛋白比MLC5f-A、MLC5f-B及MLC5f-C選擇性剪接體編碼蛋白多一個結(jié)合鈣蛋白質(zhì)功能域。同時，不同組織RT-PCR結(jié)果表明，MLC1f和MLC3f在骨骼肌與心肌中表達，ML

38、C5f-A、MLC5f-B及MLC5f-C只在骨骼肌中表達（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表），表明心肌與骨骼肌中該基因產(chǎn)物有關(guān)鈣結(jié)合的功能可能存在差異，因此不同剪切體在不同肌肉類型中的差異表達可能與不同肌肉的發(fā)育、功能特點相關(guān)。推測5種剪切體的共有區(qū)域可能是該基因產(chǎn)物所必需的基本功能域，而可變區(qū)的轉(zhuǎn)錄表達取決于肌肉類型，這需要做進一步證實和深入研究，為該基因?qū)ωi肌肉類型形成的影響機制的研究奠定基礎(chǔ)。參考文獻：vertebratemyogenesisJ.DevBiol,1995,171(2):665-676.7ChavesLD,OstroskiBJ,ReedKM.MyosinlightchaingenesintheturkeyJ.CytogeneticandGenomeResearch,2003