丙戊酸鈉誘導骨髓增生異常綜合征細胞株 MUTZ1凋亡的實驗研究

1、丙戊酸鈉誘導骨髓增生異常綜合征細胞株 MUTZ1凋亡的實驗研究         08-03-03 15:22:00     編輯：studa20     作者：趙慧慧，陳寶安, 高沖，邵澤葉，夏國華，丁家華，孫耘玉，【摘要】  為了探討丙戊酸鈉( sodium valproate， VPA)對骨髓增生異常綜合征細胞株MUTZ1的生長抑制及誘導凋亡作用，采用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測VPA對細胞生長的抑制作用；采用光學顯

2、微鏡和電子顯微鏡觀察VPA作用后細胞形態(tài)的變化；應用流式細胞術(shù)(FCM)檢測不同濃度VPA作用后細胞凋亡的比例和細胞周期分布的變化。結(jié)果顯示： VPA對MUTZ1細胞的生長抑制作用呈現(xiàn)時間和劑量依賴性；經(jīng)4 mmol/L VPA處理MUTZ1細胞72小時后,細胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)特征，光學顯微鏡下可見凋亡細胞胞體固縮、核固縮、核碎裂及凋亡小體；透射電子顯微鏡下可見凋亡細胞核染色質(zhì)邊集、胞漿濃縮、密度增加，胞漿內(nèi)大小不規(guī)則的染色質(zhì)團塊；流式細胞術(shù)結(jié)果表明，細胞凋亡率隨著VPA濃度的增加而逐步增高，G0/G1期細胞比例隨著VPA濃度的增加而逐漸增多，S期細胞比例逐漸減低,細胞被阻滯在G0/G1期。

3、結(jié)論： VPA通過G0/G1期阻滯誘導MUTZ1細胞凋亡，從而抑制MUTZ1細胞增殖。 【關(guān)鍵詞】  骨髓增生異常綜合征      Apoptosis of Human Myelodysplastic Syndrome Cell Line MUTZ1 Induced by Sodium Valproate       Abstract    To study the effects of sodium valproate (VPA) on hum

4、an myelodysplastic syndrome cell line MUTZ1. The  cell proliferation was determined by  MTT assay, apoptotic morphological features were observed by light microscopy and transmission electronmicroscopy, cell apoptosis and cell cycle shift were analyzed by flow cytometry (FCM). The results

5、showed that VPA could inhibit the growth of MUTZ1 cells in doseand timedependent manners. The typical apoptotic morphological features appeared in MUTZ1 cells treated with 4 mmol/L VPA for 72 hours. Pyknosis of cells and nuclei, disintegration of nuclear chromatin and apoptotic body could be observe

6、d by light microscopy. Aggregation and margination of  nuclear chromatin,     concentration of plasm, increment of density and chromatin mass of irregular size could be observed by  transmission electronmicroscope. The flow cytometric analysis indicated that the VPA cou

7、ld induce cell apoptosis, apoptosis rate increased in dosedependent manner, ratio of cells at G0/G1 phase increased and ratio of cells at S phase decreased  in dosedependent manner, the cells were arrested at G0/G1 phase. It is concluded that the VPA can induce apotosis and inhibite proliferati

8、on of MUTZ1 cells via arresting cells at G0/G1 phase.    Key words    sodium valproate； MDS； MUTZ1 cell line； apoptosis    J Exp Hematol 2007; 15(4):743-747    骨髓增生異常綜合征(MDS)是一組以血細胞質(zhì)、量異常和高風險發(fā)展為急性白血病為特征的惡性克隆性造血干細胞疾病。由于本病具有高度的異質(zhì)性,目前臨床尚無明確有效的治

9、療方法。組蛋白去乙?；敢种苿℉DACI）可通過誘導細胞周期停滯、細胞凋亡抑制多種腫瘤細胞的生長增殖1-3，它的應用標志著一種全新的腫瘤治療途徑。丙戊酸鈉(sodium valproate, VPA)是一種傳統(tǒng)的抗癲癇病藥物，毒副作用輕微，長期使用耐受性好，其在抗癲癇病有效治療濃度時表現(xiàn)出很強的HDACI活性4。    本實驗研究了VPA抑制MDS細胞株MUTZ1生長增殖以及誘導其凋亡的作用。     制劑和試劑    VPA由連云港恒瑞制藥廠惠贈,純度為99.2% ,分子式為C8H15NaO

10、2,以PBS配制成0.5 mol/L濃度,過濾分裝,貯存于-20,實驗證明所用藥物濃度的PBS含量對細胞生長無影響。RPMI 1640培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品，小牛血清購自杭州四季清有限公司，四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲亞砜（DMSO）為Sigma公司產(chǎn)品，Annexin VFITC凋亡和細胞周期分析試劑盒為Becton Dickinson公司產(chǎn)品。    細胞和細胞培養(yǎng)    人MDS細胞株MUTZ1來源自德國Brauschweig細胞中心5。MUTZ1是MDSRAEB細胞系,免疫表型顯示前B細胞的表面標記(CD10+,CD19

11、+,cyIgM+),染色體核型表現(xiàn)為高頻率的染色單體斷裂及交換、5號染色體長臂的丟失6。細胞在5% CO2, 37條件下,用含10%小牛血清,青霉素(100 U/ml),鏈霉素(100 g/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代。實驗所用細胞均處于對數(shù)生長期，臺盼藍拒染法表明細胞活力95%。    MTT比色試驗    取對數(shù)生長期細胞，洗滌，重懸于含10%小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞終濃度為1×105/ml，接種于96孔板,加入不同濃度的VPA,每孔總體積為200 l,另設(shè)空白孔和對照孔，每個濃度設(shè)5個復

12、孔,分別于加藥后0、1、2、3和4天進行檢測,于每次檢測前4小時每孔加入MTT溶液(5 mg/ml) 20 l; 37，5% CO2條件下繼續(xù)孵育4小時,然后終止培養(yǎng)，離心、棄上清,每孔加入150 l  DMSO,搖床混勻充分溶解結(jié)晶物；在全自動酶標儀波長540 nm處測定吸光度A值。試驗重復3次,取平均值。    光學顯微鏡下細胞形態(tài)學觀察    4 mmol/L VPA處理MUTZ1細胞72小時后收集細胞懸液,離心 ,涂片,常規(guī)WrightGiemsa染色,觀察細胞形態(tài)。    透射電子顯微

13、鏡下細胞形態(tài)學觀察    4 mmol/L VPA處理MUTZ1細胞72小時后收集細胞懸液,離心后快速固定于2.5%的冷戊二醛液中，2小時后，1%鋨酸再固定1小時，丙酮梯度脫水，Epon812樹脂包埋，半薄切片定位，70 nm超薄切片，醋酸鈾檸檬酸鉛雙重電子染色，在JEM1200透射電子顯微鏡下觀察。    細胞凋亡和細胞周期的流式細胞術(shù)檢測    分別收集0、1、2和4 mmol/L VPA處理72小時的細胞, 4用PBS洗滌2次,1×AnnexinV緩沖液懸浮細胞,調(diào)整細胞濃度為1×

14、;106/ml,取100 l懸液,加入AnnexinVFITC 5 l， PI  10 l，避光孵育15分鐘,每管加入300 l的1×AnnexinV緩沖液,FCM檢測凋亡細胞陽性率。AnnexinV()PI()為活細胞, AnnexinV()PI(+)為機械損傷細胞， AnnexinV(+)PI()為早期凋亡細胞, AnnexinV (+)PI(+)為晚期凋亡細胞，實驗中以AnnexinV（+）作為凋亡細胞。    分別收集0、1、2和4 mmol/L VPA處理72小時的細胞(約2×106個),用PBS洗滌2次,用70%的冷乙醇于

15、4下固定24小時以上,離心并重懸于1 ml PBS,加1 ml  PC緩沖液,置室溫20分鐘,離心去上清,加100 g/ml RNase 50 l,再加入50 g/ml PI  500 l ,4 室溫避光30分鐘，F(xiàn)CM分析細胞周期。    統(tǒng)計分析    應用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計,應用t檢驗分析實驗組和對照組之間的差異,以p0.05為差異具有顯著意義。    結(jié)    果    VPA對MUTZ1細胞生長的抑制作用    0.5 mmol/L  VPA作用于MUTZ1細胞后對細胞的生長增殖無明顯影響（p0.05），而較高濃度（1-6 mmol/L）的VPA可明顯抑制細胞的