高效液相色譜法測(cè)定川芎不同炮制品中游離阿魏酸和總阿魏酸的含量

1、高效液相色譜法測(cè)定川芎不同炮制品中游離阿魏酸和總阿魏酸的含量                          作者：夏荃，文惠玲，李土光 賀潔兒【摘要】  【目的】測(cè)定并比較川芎不同炮制品中游離阿魏酸、總阿魏酸的含量?！痉椒ā坎捎贸曁崛》?，以甲醇甲酸(955,V/V)為游離阿魏酸的提取溶劑，以甲醇20 g/L NaHCO3(955,V

2、/V)為總阿魏酸的提取溶劑;采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定，色譜條件為：Diamonsil C18分析柱(250 mm×4?6 mm，5 m);流動(dòng)相為乙腈體積分?jǐn)?shù)1%冰醋酸(2080,V/V);檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm;流速:1?0 mL/min;柱溫：室溫?！窘Y(jié)果】酒炙川芎的游離阿魏酸和總阿魏酸含量均高于生品及制川芎。川芎生品與不同制品水煎液中阿魏酸含量均高于其游離阿魏酸含量?！窘Y(jié)論】本研究含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于川芎及其炮制品中阿魏酸含量的測(cè)定研究;測(cè)定川芎中總阿魏酸的含量更能反映川芎的質(zhì)量。 【關(guān)鍵詞】  川芎/生產(chǎn)與制備;川芎/化學(xué);阿魏酸/分析;色譜法，

3、高壓液相川芎為傘形科多年生草本川芎Ligusticum chuanxiong Hort?鋇母?莖1，具有行氣活血、祛風(fēng)止痛之功效，臨床上有生川芎、酒炙川芎以及制川芎(廣東習(xí)用)等多個(gè)炮制品種。川芎中含有內(nèi)酯類(lèi)、生物堿、有機(jī)酸類(lèi)或酚類(lèi)以及中性油類(lèi)等多種有效成分2，其中阿魏酸具有較強(qiáng)的生理活性，具有抑制血小板聚集、解除血管平滑肌痙攣、抗氧化和提高膜穩(wěn)定性以及抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫功能等藥理作用3-4。在川芎的質(zhì)量控制研究中，以阿魏酸的定量分析較多，采用了不同的提取溶劑及提取方法，所測(cè)得阿魏酸的含量從0?49 mg/g至2?14 mg/g不等5-8。有文獻(xiàn)報(bào)道9，當(dāng)歸中的阿魏酸松柏酯，因提取工藝不同可

4、以在一定條件下水解為阿魏酸，故提出了游離阿魏酸和總阿魏酸的概念，前者為藥材中的阿魏酸，而后者為游離阿魏酸及其衍生物水解所得阿魏酸之和，因此僅測(cè)定游離阿魏酸不足以反映藥材的質(zhì)量。川芎中亦含有阿魏酸松柏酯，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定并比較了川芎不同炮制品中游離阿魏酸、總阿魏酸的含量，并對(duì)川芎不同炮制品水煎液中的阿魏酸含量進(jìn)行了測(cè)定，現(xiàn)報(bào)道如下。1材料與方法1?1主要儀器與試劑天美高效液相色譜儀(包括HITACHI LC2130泵、L2200自動(dòng)進(jìn)樣器、LC2030紫外檢測(cè)器、T2000P工作站);CQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);試驗(yàn)所用水為超純水，乙腈為色譜純，其他所用試劑均為分析純。1?2

5、藥物川芎藥材購(gòu)自廣州市大翔藥材有限公司，經(jīng)過(guò)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李薇教授鑒定為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort?鋇母?莖;阿魏酸對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110773?200611。1?3藥物制備取原藥材，除去雜質(zhì)，洗凈，悶潤(rùn)，切薄片，低溫烘干，篩去碎屑，制備生川芎飲片10;取生川芎片，按質(zhì)量比101加入黃酒拌勻，稍悶潤(rùn)，待酒被吸盡后，置炒制容器內(nèi)，用文火加熱，炒至棕黃色時(shí)，取出晾涼，篩去碎屑，制備酒炙川芎飲片10;取凈川芎，用水浸3 h，撈起，瀝干水，按質(zhì)量比101加入黃酒拌勻，待酒被吸盡后，蒸3 h至透心，取出，放冷，切薄片，

6、低溫烘干，篩去碎屑，制備制川芎飲片11。1?4提取溶劑的確定采用超聲提取方法，選取了甲醇，甲醇水(955,V/V)，甲醇甲酸(955,V/V)，甲醇?20 g/L NaHCO3(955,V/V)等提取溶劑進(jìn)行比較，采用高效液相色譜(HPLC)法，色譜條件為A：體積分?jǐn)?shù)0?1%冰醋酸水溶液,B:乙腈;梯度洗脫：體積分?jǐn)?shù)19%B 018 min，18%60%B 1860 min;檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm;流速:1?0 mL/min;柱溫:30 ;進(jìn)樣量:10 L，觀察HPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)阿魏酸的含量發(fā)生規(guī)律性的變化，在用甲醇?20 g/L NaHCO3為溶劑提取時(shí)，阿魏酸峰(A峰)面積增大，而B(niǎo)峰(根

7、據(jù)文獻(xiàn)9推測(cè)可能為阿魏酸松柏酯峰)幾乎消失;以甲醇甲酸為溶劑提取時(shí)，A峰面積最小，B/ A峰面積比最大(圖1)。按照文獻(xiàn)9方法測(cè)定游離阿魏酸以盡量保留B峰，測(cè)定總阿魏酸則以B峰消失，A 峰明顯增大為標(biāo)準(zhǔn)。故選用甲醇甲酸作為提取川芎藥材游離阿魏酸的溶劑，以甲醇20 g/L NaHCO3為提取總阿魏酸的溶劑。1?奔狀肌?20 g/L NaHCO3;2?奔狀肌?水;3?奔狀?;4?奔狀肌?甲酸1?5提取時(shí)間的確定以甲醇甲酸及甲醇20 g/L NaHCO3為提取溶劑，對(duì)20、40、60、100 min等超聲時(shí)間進(jìn)行考察， 60 min后阿魏酸峰面積均不再明顯變化，故選擇60 min作為超聲提取時(shí)間。1

8、?6對(duì)照品溶液的制備稱(chēng)取阿魏酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，先用少量甲醇全部溶解標(biāo)準(zhǔn)品，再以甲酸水溶液(595,V/V)定容至刻度，制得濃度為232?4 g/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。1?7供試品溶液的制備1?7?1游離阿魏酸樣品制備取約0?5 g藥材粉末(過(guò)20目篩)，精密稱(chēng)定質(zhì)量，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇甲酸溶液，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲60 min，放冷，用提取溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)0?45 m微孔濾膜，收取續(xù)濾液作為供試品溶液。1?7?2總阿魏酸樣品制備取約0?5 g藥材粉末(過(guò)20目篩)，精密稱(chēng)定質(zhì)量，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇20 g/L NaHCO3溶液，稱(chēng)定質(zhì)量，

9、超聲60 min，放冷，用提取溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)0?45 m微孔濾膜，收取續(xù)濾液作為供試品溶液。1?7?3水煎液樣品制備取約0?5 g藥材粉末(過(guò)20目篩)，精密稱(chēng)定質(zhì)量，精密加入25 mL蒸餾水，稱(chēng)定質(zhì)量，浸泡30 min，回流1 h，放冷，用蒸餾水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)0?45 m微孔濾膜，收取續(xù)濾液作為供試品溶液。1?8色譜條件美國(guó)迪馬公司Diamonsil C18分析柱(250 mm×4?6 mm，5 m);流動(dòng)相為乙腈體積分?jǐn)?shù)1%冰醋酸(2080,V/V);檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm;流速：1?0 mL/min;柱溫：室溫。進(jìn)樣量：10 L。色譜圖見(jiàn)圖2。百事通2結(jié)

10、果2?1線(xiàn)性關(guān)系考察精密量取阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置10 mL棕色量瓶中，加甲酸水溶液(595,V/V)定容至刻度，搖勻，配制成濃度為2?324、4?648、11?620、 23?240、46?480 g/mL的對(duì)照品溶液，分別取上述溶液各10 L注入液相色譜儀，按1?8項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。以各對(duì)照品進(jìn)樣量(X/g)對(duì)峰面積(Y/mAu)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)方程：Y= 5132092?09 X+15 233?67 (r=0?999 9)，線(xiàn)性范圍0?023 240?46 48 g。2?2精密度試驗(yàn)取同一對(duì)照品溶液，按1?8項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定阿魏酸峰面積sR為1?35%，表明

11、儀器精密度良好。2?3重復(fù)性試驗(yàn)取川芎生品，按1?7項(xiàng)下供試品溶液的制備方法分別制備5份供試品溶液，按1?8項(xiàng)下色譜條件測(cè)定游離阿魏酸平均含量為0?364 mg/g，sR為2?98%;總阿魏酸平均含量為1?03 mg/g，sR為2?38%。本方法重現(xiàn)性良好。2009年第26卷廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)2?4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一供試品，按1?7項(xiàng)下供試品溶液的制備方法分別制備游離阿魏酸供試品溶液及總阿魏酸供試品溶液，并分別在0、5、10、15、20、24 h進(jìn)樣1次，按1?8項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，阿魏酸峰面積sR分別為1?15%、1?68%，表明供試品24 h內(nèi)穩(wěn)定。2?5回收率試驗(yàn)精密稱(chēng)取6份已知含量的

12、供試品各約0?25 g，每份添加對(duì)照品適量，按1?7項(xiàng)下供試品溶液的制備方法處理，1?8項(xiàng)下色譜條件測(cè)得游離阿魏酸及總阿魏酸含量，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1、表2。2?6樣品含量測(cè)定精密吸取供試品溶液10 L，注入高效液相色譜儀，按1?8項(xiàng)下色譜條件測(cè)定游離阿魏酸和總阿魏酸峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3、表4、表5。表1游離阿魏酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表2總阿魏酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表3川芎生品及不同炮制品中游離阿魏酸含量測(cè)定表4川芎生品及不同炮制品中總阿魏酸含量測(cè)定表5川芎生品及不同炮制品水煎液中阿魏酸含量測(cè)定3討論川芎中含有阿魏酸和阿魏酸松柏酯，其中阿魏酸松柏酯在中性、強(qiáng)酸或堿性條件下可以水解生成阿

13、魏酸，即使水浴加熱都可能不同程度地發(fā)生，但弱有機(jī)酸可以抑制水解過(guò)程9。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甲醇甲酸溶液能較好地抑制阿魏酸松柏酯的水解，而在甲醇20 g/L NaHCO3中則幾乎全部水解，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致9。炮制加工可以引起川芎中阿魏酸含量的變化，其中游離阿魏酸的含量：酒炙川芎廣東制川芎生川芎;總阿魏酸的含量：酒炙川芎生川芎廣東制川芎。按照全國(guó)炮制規(guī)范所制的酒炙川芎游離阿魏酸及總阿魏酸含量均高于生品，可能與酒炙過(guò)程可增加阿魏酸的溶出有關(guān)。由于廣東地區(qū)習(xí)用的制川芎為蒸制所得，在炮制過(guò)程中阿魏酸和阿魏酸松柏酯都可能發(fā)生水解等變化，導(dǎo)致阿魏酸含量的下降。但與生川芎與酒炙川芎相比，制川芎有更濃郁的香氣，是否

14、還伴隨揮發(fā)油等其他成分的變化，尚需進(jìn)一步研究。川芎生品及不同炮制品水煎液中阿魏酸的含量：酒炙川芎生川芎廣東制川芎，且均高于以甲醇甲酸為提取溶劑測(cè)得的游離阿魏酸的含量，說(shuō)明在水煎煮的過(guò)程中，已存在阿魏酸松柏酯的水解，故僅測(cè)定川芎中游離阿魏酸的含量不足以反映藥材的質(zhì)量。另外，在許多文獻(xiàn)中，川芎中阿魏酸的測(cè)定結(jié)果有較大偏差，很可能為未考慮到有水解反應(yīng)的發(fā)生，對(duì)提取溶劑未做進(jìn)一步研究的結(jié)果?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典S.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005:28.2 陰健，郭力弓.中藥現(xiàn)代化研究與臨床應(yīng)用M.北京：學(xué)苑出版社，1993:108.3 楊奎,周明眉,姜遠(yuǎn)平,

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