Avermectin B1a組分高產菌株的誘變育種(一)

1、Avermectin B1a組分高產菌株的誘變育種(一)    作者：任超 馬王向坡 李寶庫 路新利【關鍵詞】 Avermectin,B1a組分；,誘變；,效價；,高產菌株 摘要： 目的 了解avermectin產生菌S.avermitilis的生長特性，提高產生菌B1a組分的產量。方法 采用紫外線、誘變劑亞硝基胍并結合甲硫氨酸誘變等手段對出發(fā)菌株S.avermitilis N56進行誘變處理，初篩、復篩。結果 篩選獲得總效價達到45258g/ml的高產除蟲鏈霉菌突變株A3，B1a比例提高到560%。結論 采用紫外線及亞硝基胍誘變方法，結合甲硫氨酸誘變篩

2、選，與出發(fā)菌株相比可以獲得avermectin總效價及B1a組分顯著提高的菌株。關鍵詞： Avermectin B1a組分； 誘變； 效價； 高產菌株ABSTRACT Objective To study the characteristics of avermectin producing strains and improve avermectin B1ayield of Streptomyces avermitilis. Method UV and NTG were used as mutagens to treat the original strain N56 as well as

3、methionine as inducer. Results The highyield avermectin strain A3 with avermectin total titer up to 45258 g/ml was obtained, the ratio of avermectin B1awas increased to 560%. Conclusion It is an effective method of screening highyield avermectin B1athrough mutation by UV and NTG and induction with m

4、ethionine.KEY WORDS Avermectin B1a; Mutagenesis; Titer; Highavermectinproducing strainAvermectin的產生菌是除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)，該菌株是1975年日本北里研究所(Kitasato Institute)從日本靜崗縣地區(qū)的一個土壤樣品中分離得到的。研究初期已發(fā)現(xiàn)該菌株的發(fā)酵液具有很高的驅腸道寄生蟲活性，該菌株后被送到美國Merck公司作進一步研究。1976年，美國Merck公司的科研人員分離了這組具有驅蟲活性的物質，并將其命名為avermectins1。Aver

5、mectins是一類結構相似的十六元大環(huán)內酯類抗生素，共有8個組分，分別命名為A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a和B2b。其中A1a、A2a、B1a和B2a為4個大量組分，含量在80%以上；A1b、A2b、B1b和B2b為4個小量組分，含量在20%以下，結構見圖1。B1的殺蟲活性最高，毒性最小。近年，眾多科研工作者通過誘變等手段改造菌種的遺傳特性，提高avermectin有效組分B1比例，大村智等在這方面做了很多貢獻2。Avermectin B1a(大于80%)和B1b(小于20%)混合物阿巴菌素(abamectin)已用于畜牧抗蟲和農業(yè)上的殺螨及選擇性的殺蟲劑。Averm

6、ectins R1 XY R2A1a CH3 CH=CH C2H5A1b CH3 CH=CH CH3A2a CH3 CH2-CH(OH) C2H5A2b CH3 CH2-CH(OH) CH3B1a H CH=CH C2H5B1b H CH=CH CH3B2a H CH2-CH(OH) C2H5B2b H CH2-CH(OH) CH3圖1 Avermectins結構圖1 材料和儀器1.1 菌種除蟲鏈霉菌S.avermitilis N56由河北大學微生物研究所提供；突變株A3由甲硫氨酸平板篩選獲得。1.2 試劑生理鹽水，亞硝基胍(NTG)，磷酸鹽緩沖液(pH60)，甲硫氨酸(Met)，丙酮(分析純

7、)，乙酸乙酯(分析純)，無水甲醇(色譜純及分析純)，GF254硅膠粉，三氯甲烷(分析純)，二氯甲烷(分析純)。1.3 培養(yǎng)基斜面和分離培養(yǎng)基(g/L) 可溶性淀粉10，(NH4)2SO4 25，NaCl 06，MgSO4?7H2O 12，K2HPO4?3H2O 30，CaCO3 30，瓊脂粉20，pH7274，用蒸餾水配制。種子培養(yǎng)基(g/L) 玉米淀粉25，花生餅粉10，黃豆餅粉80，酵母粉50，酵母膏50，玉米漿40，CoCl2?6H2O 0003，淀粉酶00025，pH7072，用自來水配制。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 玉米淀粉70，花生餅粉10，黃豆餅粉80，酵母粉50，酵母膏30，玉米漿2

8、2，CoCl2?6H2O 0003，淀粉酶00025，pH7072，用自來水配制。1.4 誘變及篩選方法1.4.1 紫外線誘變 取制備好的菌懸液5ml移入直徑為90mm的無菌培養(yǎng)皿中，放入無菌磁力攪拌棒，置于磁力攪拌器上，功率20W，波長254nm紫外燈下30cm處打開皿蓋邊攪拌邊照射，劑量分別為15、30、45、60和75s，可以累積照射，也可分別照射不同時間。取不同照射時間段的菌懸液1ml，進行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7梯度稀釋，取10-3、10-5、和10-7濃度的稀釋液各01ml涂布于分離平板上，用黑紙包嚴，28倒置培養(yǎng)79d。1.4.2 亞硝

9、基胍(NTG)誘變 用01mol/L，pH60的磷酸鹽緩沖液制備孢子懸液，使?jié)舛葹?08個/ml，分別用1、2、3和4mg/ml濃度的NTG處理紫外誘變后的突變株單孢子懸液，于28震蕩30min，用生理鹽水離心洗滌孢子3次，經稀釋后涂布于分離平板28倒置培養(yǎng)79d。1.4.3 甲硫氨酸(Met)誘變 將不含甲硫氨酸的斜面培養(yǎng)基20ml倒入培養(yǎng)皿中，待凝固后倒入10ml含有不同濃度的Met斜面培養(yǎng)基，終濃度分別為025、050、10mg/ml。處理后的孢子懸液稀釋后涂布于平板上，28倒置培養(yǎng)79d3，挑取優(yōu)勢單菌落轉接于斜面，28溫箱培養(yǎng)。1.5 搖瓶發(fā)酵從平板上挑取灰色豐滿的單菌落轉接于斜面，

10、28培養(yǎng)79d，將長出豐富的灰色孢子轉接于種子培養(yǎng)液，220r/min，28搖床培養(yǎng)2830h，接種5%于發(fā)酵培養(yǎng)液(250ml三角瓶，裝50ml發(fā)酵液)，220r/min，28搖床培養(yǎng)79d，放瓶測定效價。1.6 效價測定菌絲溶媒萃取 取發(fā)酵液5ml，3000r/min，離心10min，棄上清。加入丙酮2ml，在旋渦式混合器上振蕩1min，靜置10min，重復3次。加入乙酸乙酯3ml，振蕩1min，3000r/min，離心10min，上清液備用。層析法分離純化 吸取40l上清液點樣于GF254硅膠板上，然后層析。展層劑為：乙酸乙酯三氯甲烷二氯甲烷無水甲醇=9921。層析后在紫外燈下觀察，將斑

11、點處硅膠刮入離心管中，加入2ml無水甲醇，在旋渦式混合器上振蕩1min，靜置10min后3000r/min，離心10min。HPLC法測定效價 采用C18反相柱，流動相為無水甲醇水(8515)，流速1ml/min，檢測波長2446nm。準確吸取200l樣品濾液進樣，根據(jù)各組分的峰面積，對照標準曲線計算其含量，各組分之和即為總發(fā)酵效價。2 結果2.1 紫外線誘變經紫外線誘變、培養(yǎng)后，活菌計數(shù)，計算誘變后的正突變率及孢子致死率，結果如表1。實驗中觀察到該菌株對紫外線異常敏感，紫外照射時間超過60s，孢子致死率幾乎達到100%。所以紫外線照射時間應嚴格控制在60s以內，這有別于其它的一般鏈霉菌。隨機

12、挑取一定數(shù)量菌株經UV誘變的灰色菌落發(fā)酵培養(yǎng)后測定avermectin的產量，發(fā)現(xiàn)其產抗能力較出發(fā)菌落均有明顯提高。再從中挑選24個產抗能力強的菌落在平板上反復傳代，進一步發(fā)酵篩選，獲得一菌落特性和產量都較為穩(wěn)定的突變株A1，發(fā)酵效價達24657g/ml，B1a的比例為371%，較出發(fā)菌株有明顯提高。將此突變株進行下一步誘變處理。表1 除蟲鏈霉菌N56的紫外線誘變效果 照射時間2.2 NTG誘變及篩選隨機挑取經NTG誘變后的單菌落轉接于斜面，進行篩選，實驗結果如表2。由表2可知，在pH 60條件下，NTG的作用濃度為1mg/ml時誘變效果最佳。與出發(fā)菌株相比，正突變率達到161%，大于其它處理

13、條件，負突變率最低為448%。但隨著NTG濃度的增大，孢子的死亡率逐漸增加，產量正突變率逐漸降低，負突變率逐漸增加。當NTG濃度達到3mg/ml以上時，正突變率為零，負突變率85%89%。因此用低濃度的NTG作為誘變劑進行菌種選育。經分離、篩選獲得突變株A2。2.3 Met平板篩選已研究證實Met可促進S腺苷甲硫氨酸(SAM) 表2 NTG的誘變結果NTG濃度因此篩選降解甲硫氨酸能力強的菌株，使甲硫氨酸盡可能地流向能量代謝4，以減少SAM合成前體的供給，使菌體內SAM含量相對降低，獲得B組分含量較高的菌株。向培養(yǎng)基中加入低濃度的Met，誘變菌體降解甲硫氨酸的能力。向培養(yǎng)基中加入低濃度的甲硫氨酸

14、，在pH60，1mg/ml NTG，28水浴處理30min的誘變條件下，誘變效果見圖2。由圖2可知，加入Met后菌株A2的孢子致死率顯著上升，avermectin正突變率比單純NTG誘變有所下降，負突變率增加，但B1a組分比例正突變率顯著上升。加入025mg/ml的Met，B1a組分比例增加的菌株達到149%。隨著Met濃度的升高，菌落生長明顯受到抑制，孢子明顯減少，B1a組分比例正突變率有所下降。實驗分離、篩選獲得突變菌株A3。2.4 搖瓶效價分析由表3可看出，誘變處理出發(fā)菌株，獲得的突變株A3的總效價及B1a百分比例均顯著提高，前者效價達到45258g/ml，后者組分提高560%，明顯高于

15、出發(fā)菌株N56。2.5 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性考察將誘變獲得的突變菌株A3通過斜面?zhèn)鞔玫礁鞔有泵婢旰筮M行搖瓶發(fā)酵，測定各代菌株產量及B1a組分含量的穩(wěn)定性，F(xiàn)1F5代的發(fā)酵總效價及avermectin中B1a組分比例見表4 表3 出發(fā)菌株和突變菌株的搖瓶效價測試比較由表4可見，突變株經A3多次傳代，avermectin總效價雖有所下降，但其B1a組分比例基本上比較穩(wěn)定。證實本實驗中所用的誘變篩選方法可有效篩選出avermectin B1a高產菌株。3 討論(1)avermectin產生菌的菌落特征很不穩(wěn)定，存在嚴重的自然分化現(xiàn)象，在不同菌落形態(tài)的分化菌株中，產灰色孢子的菌株能產生aver

16、mectin，但即使經單孢子選出的灰色菌落經傳代后，仍分化出不產avermectin的白色和光禿菌落，因此誘變處理后應從分離培養(yǎng)基上挑取產抗能力強的灰色孢子進行發(fā)酵培養(yǎng)，以平衡經常出現(xiàn)的發(fā)酵效價不穩(wěn)定現(xiàn)象。(2)菌體內S腺苷甲硫氨酸(SAM)濃度起到調控avermectins的C5位甲氧基化程度作用。當菌體內SAM含量升高時，可以增加avermectin A組分的比例，而減少菌體內SAM的含量可以使B組分的比例升高，B1a組分的比例也隨之得以提高。所以，為了增加其有效次級代謝產物B1a組分的比例，在分離平板中加入低濃度的Met，誘變篩選出降解甲硫氨酸能力強的菌株，減少了產物中avermectin A組分的生物合成，提高了有效組分B1a的比例。參考文獻1 宋淵，曹貴明，陳芝，等. 阿維菌素高產菌株的選育及阿維菌素B1鑒定J. 生物工程學報，2000，16(1)：312 Ikeda H, Omura S. Avermectin bios