Avermectin B1a組分高產(chǎn)菌株的誘變育種

1、Avermectin B1a組分高產(chǎn)菌株的誘變育種            作者：任超 馬王向坡 李寶庫(kù) 路新利【要害詞】 Avermectin,B1a組分；,誘變；,效價(jià)；,高產(chǎn)菌株 摘要： 目的 了解avermectin產(chǎn)生菌S.avermitilis的生長(zhǎng)特性，提高產(chǎn)生菌B1a組分的產(chǎn)量。方法 采用紫外線、誘變劑亞硝基胍并結(jié)合甲硫氨酸誘變等手段對(duì)出發(fā)菌株S.avermitilis N56進(jìn)行誘變處理，初篩、復(fù)篩。結(jié)果 篩選獲得總效價(jià)達(dá)到45258g/ml的高產(chǎn)除蟲鏈霉菌突

2、變株A3，B1a比例提高到560%。結(jié)論 采用紫外線及亞硝基胍誘變方法，結(jié)合甲硫氨酸誘變篩選，與出發(fā)菌株相比可以獲得avermectin總效價(jià)及B1a組分顯著提高的菌株。要害詞： Avermectin B1a組分； 誘變； 效價(jià)； 高產(chǎn)菌株    ABSTRACT Objective To study the characteristics of avermectin producing strains and improve avermectin B1ayield of Streptomyces avermitilis. Method UV and N

3、TG were used as mutagens to treat the original strain N56 as well as methionine as inducer. Results The highyield avermectin strain A3 with avermectin total titer up to 45258 g/ml was obtained, the ratio of avermectin B1awas increased to 560%. Conclusion It is an effective method of screening highyi

4、eld avermectin B1athrough mutation by UV and NTG and induction with methionine.KEY WORDS Avermectin B1a; Mutagenesis; Titer; Highavermectinproducing strain    Avermectin的產(chǎn)生菌是除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)，該菌株是1975年日本北里研究所(Kitasato Institute)從日本靜崗縣地區(qū)的一個(gè)土壤樣品中分離得到的。研究初期已發(fā)現(xiàn)該菌株的發(fā)酵液具有

5、很高的驅(qū)腸道寄生蟲活性，該菌株后被送到美國(guó)Merck公司作進(jìn)一步研究。1976年，美國(guó)Merck公司的科研人員分離了這組具有驅(qū)蟲活性的物質(zhì)，并將其命名為avermectins1。Avermectins是一類結(jié)構(gòu)相似的十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，共有8個(gè)組分，分別命名為A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a和B2b。其中A1a、A2a、B1a和B2a為4個(gè)大量組分，含量在80%以上；A1b、A2b、B1b和B2b為4個(gè)小量組分，含量在20%以下，結(jié)構(gòu)見圖1。B1的殺蟲活性最高，毒性最小。近年，眾多科研工作者通過誘變等手段改造菌種的遺傳特性，提高avermectin有效組分B1比例，大

6、村智等在這方面做了很多貢獻(xiàn)2。Avermectin B1a(大于80%)和B1b(小于20%)混合物阿巴菌素(abamectin)已用于畜牧抗蟲和農(nóng)業(yè)上的殺螨及選擇性的殺蟲劑。Avermectins R1 XY R2A1a CH3 CH=CH C2H5A1b CH3 CH=CH CH3A2a CH3 CH2-CH(OH) C2H5A2b CH3 CH2-CH(OH) CH3B1a H CH=CH C2H5B1b H CH=CH CH3B2a H CH2-CH(OH) C2H5B2b H CH2-CH(OH) CH3圖1 Avermectins結(jié)構(gòu)圖    

7、;1 材料和儀器    1.1 菌種除蟲鏈霉菌S.avermitilis N56由河北大學(xué)微生物研究所提供；突變株A3由甲硫氨酸平板篩選獲得。    1.2 試劑生理鹽水，亞硝基胍(NTG)，磷酸鹽緩沖液(pH60)，甲硫氨酸(Met)，丙酮(分析純)，乙酸乙酯(分析純)，無水甲醇(色譜純及分析純)，GF254硅膠粉，三氯甲烷(分析純)，二氯甲烷(分析純)。    1.3 培養(yǎng)基斜面和分離培養(yǎng)基(g/L) 可溶性淀粉10，(NH4)2SO4 25，NaCl 06，MgSO47

8、H2O 12，K2HPO43H2O 30，CaCO3 30，瓊脂粉20，pH7274，用蒸餾水配制。種子培養(yǎng)基(g/L) 玉米淀粉25，花生餅粉10，黃豆餅粉80，酵母粉50，酵母膏50，玉米漿40，CoCl26H2O 0003，淀粉酶00025，pH7072，用自來水配制。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 玉米淀粉70，花生餅粉10，黃豆餅粉80，酵母粉50，酵母膏30，玉米漿22，CoCl26H2O 0003，淀粉酶00025，pH7072，用自來水配制。1.4 誘變及篩選方法    1.4.1 紫外線誘變 取制備好的菌懸液5ml移入直徑為90mm的無菌培養(yǎng)皿中

9、，放入無菌磁力攪拌棒，置于磁力攪拌器上，功率20W，波長(zhǎng)254nm紫外燈下30cm處打開皿蓋邊攪拌邊照射，劑量分別為15、30、45、60和75s，可以累積照射，也可分別照射不同時(shí)間。取不同照射時(shí)間段的菌懸液1ml，進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7梯度稀釋，取10-3、10-5、和10-7濃度的稀釋液各01ml涂布于分離平板上，用黑紙包嚴(yán)，28倒置培養(yǎng)79d。    1.4.2 亞硝基胍(NTG)誘變 用01mol/L，pH60的磷酸鹽緩沖液制備孢子懸液，使?jié)舛葹?08個(gè)/ml，分別用1、2、3和4mg/ml濃度的

10、NTG處理紫外誘變后的突變株單孢子懸液，于28震蕩30min，用生理鹽水離心洗滌孢子3次，經(jīng)稀釋后涂布于分離平板28倒置培養(yǎng)79d。    1.4.3 甲硫氨酸(Met)誘變 將不含甲硫氨酸的斜面培養(yǎng)基20ml倒入培養(yǎng)皿中，待凝固后倒入10ml含有不同濃度的Met斜面培養(yǎng)基，終濃度分別為025、050、10mg/ml。處理后的孢子懸液稀釋后涂布于平板上，28倒置培養(yǎng)79d3，挑取優(yōu)勢(shì)單菌落轉(zhuǎn)接于斜面，28溫箱培養(yǎng)。    1.5 搖瓶發(fā)酵從平板上挑取灰色豐滿的單菌落轉(zhuǎn)接于斜面，28培養(yǎng)79d，將長(zhǎng)出豐富的灰色孢子轉(zhuǎn)

11、接于種子培養(yǎng)液，220r/min，28搖床培養(yǎng)2830h，接種5%于發(fā)酵培養(yǎng)液(250ml三角瓶，裝50ml發(fā)酵液)，220r/min，28搖床培養(yǎng)79d，放瓶測(cè)定效價(jià)。        1.6 效價(jià)測(cè)定菌絲溶媒萃取 取發(fā)酵液5ml，3000r/min，離心10min，棄上清。加入丙酮2ml，在旋渦式混合器上振蕩1min，靜置10min，重復(fù)3次。加入乙酸乙酯3ml，振蕩1min，3000r/min，離心10min，上清液備用。層析法分離純化 吸取40l上清液點(diǎn)樣于GF254硅膠板上，然后層析。展層劑為：乙酸乙酯三氯

12、甲烷二氯甲烷無水甲醇=9921。層析后在紫外燈下觀察，將斑點(diǎn)處硅膠刮入離心管中，加入2ml無水甲醇，在旋渦式混合器上振蕩1min，靜置10min后3000r/min，離心10min。HPLC法測(cè)定效價(jià) 采用C18反相柱，流動(dòng)相為無水甲醇水(8515)，流速1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)2446nm。準(zhǔn)確吸取200l樣品濾液進(jìn)樣，根據(jù)各組分的峰面積，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量，各組分之和即為總發(fā)酵效價(jià)。2 結(jié)果    2.1 紫外線誘變經(jīng)紫外線誘變、培養(yǎng)后，活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算誘變后的正突變率及孢子致死率，結(jié)果如表1。實(shí)驗(yàn)中觀察到該菌株對(duì)紫外線異常敏感，紫外照射時(shí)間超過6

13、0s，孢子致死率幾乎達(dá)到100%。所以紫外線照射時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制在60s以內(nèi)，這有別于其它的一般鏈霉菌。隨機(jī)挑取一定數(shù)量菌株經(jīng)UV誘變的灰色菌落發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定avermectin的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)抗能力較出發(fā)菌落均有明顯提高。再?gòu)闹刑暨x24個(gè)產(chǎn)抗能力強(qiáng)的菌落在平板上反復(fù)傳代，進(jìn)一步發(fā)酵篩選，獲得一菌落特性和產(chǎn)量都較為穩(wěn)定的突變株A1，發(fā)酵效價(jià)達(dá)24657g/ml，B1a的比例為371%，較出發(fā)菌株有明顯提高。將此突變株進(jìn)行下一步誘變處理。表1 除蟲鏈霉菌N56的紫外線誘變效果 照射時(shí)間        2.2 NTG誘變

14、及篩選隨機(jī)挑取經(jīng)NTG誘變后的單菌落轉(zhuǎn)接于斜面，進(jìn)行篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。由表2可知，在pH 60條件下，NTG的作用濃度為1mg/ml時(shí)誘變效果最佳。與出發(fā)菌株相比，正突變率達(dá)到161%，大于其它處理?xiàng)l件，負(fù)突變率最低為448%。但隨著NTG濃度的增大，孢子的死亡率逐漸增加，產(chǎn)量正突變率逐漸降低，負(fù)突變率逐漸增加。當(dāng)NTG濃度達(dá)到3mg/ml以上時(shí)，正突變率為零，負(fù)突變率85%89%。因此用低濃度的NTG作為誘變劑進(jìn)行菌種選育。經(jīng)分離、篩選獲得突變株A2。    2.3 Met平板篩選已研究證實(shí)Met可促進(jìn)S腺苷甲硫氨酸(SAM) 表2 NTG的誘變結(jié)

15、果NTG濃度因此篩選降解甲硫氨酸能力強(qiáng)的菌株，使甲硫氨酸盡可能地流向能量代謝4，以減少SAM合成前體的供給，使菌體內(nèi)SAM含量相對(duì)降低，獲得B組分含量較高的菌株。向培養(yǎng)基中加入低濃度的Met，誘變菌體降解甲硫氨酸的能力。向培養(yǎng)基中加入低濃度的甲硫氨酸，在pH60，1mg/ml NTG，28水浴處理30min的誘變條件下，誘變效果見圖2。由圖2可知，加入Met后菌株A2的孢子致死率顯著上升，avermectin正突變率比單純NTG誘變有所下降，負(fù)突變率增加，但B1a組分比例正突變率顯著上升。加入025mg/ml的Met，B1a組分比例增加的菌株達(dá)到149%。隨著Met濃度的升高，菌落生長(zhǎng)明顯受到

16、抑制，孢子明顯減少，B1a組分比例正突變率有所下降。實(shí)驗(yàn)分離、篩選獲得突變菌株A3。    2.4 搖瓶效價(jià)分析由表3可看出，誘變處理出發(fā)菌株，獲得的突變株A3的總效價(jià)及B1a百分比例均顯著提高，前者效價(jià)達(dá)到45258g/ml，后者組分提高560%，明顯高于出發(fā)菌株N56。    2.5 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性考察將誘變獲得的突變菌株A3通過斜面?zhèn)鞔?，得到各代子斜面菌株后進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)定各代菌株產(chǎn)量及B1a組分含量的穩(wěn)定性，F(xiàn)1F5代的發(fā)酵總效價(jià)及avermectin中B1a組分比例見表4 表3 出發(fā)菌株和突變菌株

17、的搖瓶效價(jià)測(cè)試比較由表4可見，突變株經(jīng)A3多次傳代，avermectin總效價(jià)雖有所下降，但其B1a組分比例基本上比較穩(wěn)定。證實(shí)本實(shí)驗(yàn)中所用的誘變篩選方法可有效篩選出avermectin B1a高產(chǎn)菌株。    3 討論(1)avermectin產(chǎn)生菌的菌落特征很不穩(wěn)定，存在嚴(yán)重的自然分化現(xiàn)象，在不同菌落形態(tài)的分化菌株中，產(chǎn)灰色孢子的菌株能產(chǎn)生avermectin，但即使經(jīng)單孢子選出的灰色菌落經(jīng)傳代后，仍分化出不產(chǎn)avermectin的白色和光禿菌落，因此誘變處理后應(yīng)從分離培養(yǎng)基上挑取產(chǎn)抗能力強(qiáng)的灰色孢子進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以平衡經(jīng)常出現(xiàn)的發(fā)酵效價(jià)不穩(wěn)定現(xiàn)象。

18、(2)菌體內(nèi)S腺苷甲硫氨酸(SAM)濃度起到調(diào)控avermectins的C5位甲氧基化程度作用。當(dāng)菌體內(nèi)SAM含量升高時(shí)，可以增加avermectin A組分的比例，而減少菌體內(nèi)SAM的含量可以使B組分的比例升高，B1a組分的比例也隨之得以提高。所以，為了增加其有效次級(jí)代謝產(chǎn)物B1a組分的比例，在分離平板中加入低濃度的Met，誘變篩選出降解甲硫氨酸能力強(qiáng)的菌株，減少了產(chǎn)物中avermectin A組分的生物合成，提高了有效組分B1a的比例。參考文獻(xiàn)    1 宋淵，曹貴明，陳芝，等. 阿維菌素高產(chǎn)菌株的選育及阿維菌素B1鑒定J. 生物工程學(xué)報(bào)，2000，

19、16(1)：31    2 Ikeda H, Omura S. Avermectin biosynthesis J. Chem Rev,1997,97(7):2951    3 Ikeda H, Wang L R, Ohta T, et al. Cloning of the gene encoding avermectin B 5Omethyltransferase in avermectinproducing Streptomyces avermitisis J. Gene,1998,206(2):175

20、0;   4 來彩霞，陳偉，劉黨生，等. L異亮氨酸產(chǎn)生菌的定向育種J. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，15(1)：47        2.2 NTG誘變及篩選隨機(jī)挑取經(jīng)NTG誘變后的單菌落轉(zhuǎn)接于斜面，進(jìn)行篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。由表2可知，在pH 60條件下，NTG的作用濃度為1mg/ml時(shí)誘變效果最佳。與出發(fā)菌株相比，正突變率達(dá)到161%，大于其它處理?xiàng)l件，負(fù)突變率最低為448%。但隨著NTG濃度的增大，孢子的死亡率逐漸增加，產(chǎn)量正突變率逐漸降低，負(fù)突變率逐漸增加。當(dāng)NTG濃度達(dá)到3m

21、g/ml以上時(shí)，正突變率為零，負(fù)突變率85%89%。因此用低濃度的NTG作為誘變劑進(jìn)行菌種選育。經(jīng)分離、篩選獲得突變株A2。    2.3 Met平板篩選已研究證實(shí)Met可促進(jìn)S腺苷甲硫氨酸(SAM) 表2 NTG的誘變結(jié)果NTG濃度因此篩選降解甲硫氨酸能力強(qiáng)的菌株，使甲硫氨酸盡可能地流向能量代謝4，以減少SAM合成前體的供給，使菌體內(nèi)SAM含量相對(duì)降低，獲得B組分含量較高的菌株。向培養(yǎng)基中加入低濃度的Met，誘變菌體降解甲硫氨酸的能力。向培養(yǎng)基中加入低濃度的甲硫氨酸，在pH60，1mg/ml NTG，28水浴處理30min的誘變條件下，誘變效果見圖2。

22、由圖2可知，加入Met后菌株A2的孢子致死率顯著上升，avermectin正突變率比單純NTG誘變有所下降，負(fù)突變率增加，但B1a組分比例正突變率顯著上升。加入025mg/ml的Met，B1a組分比例增加的菌株達(dá)到149%。隨著Met濃度的升高，菌落生長(zhǎng)明顯受到抑制，孢子明顯減少，B1a組分比例正突變率有所下降。實(shí)驗(yàn)分離、篩選獲得突變菌株A3。    2.4 搖瓶效價(jià)分析由表3可看出，誘變處理出發(fā)菌株，獲得的突變株A3的總效價(jià)及B1a百分比例均顯著提高，前者效價(jià)達(dá)到45258g/ml，后者組分提高560%，明顯高于出發(fā)菌株N56。  

23、  2.5 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性考察將誘變獲得的突變菌株A3通過斜面?zhèn)鞔?，得到各代子斜面菌株后進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)定各代菌株產(chǎn)量及B1a組分含量的穩(wěn)定性，F(xiàn)1F5代的發(fā)酵總效價(jià)及avermectin中B1a組分比例見表4 表3 出發(fā)菌株和突變菌株的搖瓶效價(jià)測(cè)試比較由表4可見，突變株經(jīng)A3多次傳代，avermectin總效價(jià)雖有所下降，但其B1a組分比例基本上比較穩(wěn)定。證實(shí)本實(shí)驗(yàn)中所用的誘變篩選方法可有效篩選出avermectin B1a高產(chǎn)菌株。    3 討論(1)avermectin產(chǎn)生菌的菌落特征很不穩(wěn)定，存在嚴(yán)重的自然分化現(xiàn)象，在不同菌落形態(tài)的分化菌株中，產(chǎn)灰色孢子的菌株能產(chǎn)生avermectin，