CCL23骨髓抑制因子1（MPIF1）對于U937細胞的增殖、凋亡和分化的影響

1、CCL23/骨髓抑制因子1（MPIF?1）對于U937細胞的增殖、凋亡和分化的影響    作者：龔晴，鄭金娥，劉偉，劉黎瓊，李?瑩，黃士昂    【摘要】 CCL23/MPIF?1是人類趨化因子CC家族的一員，在血細胞中僅在單核細胞源的樹突狀細胞中持續(xù)表達，在體內和體外實驗中對人、鼠的髓系祖細胞的增殖和分化均有明顯的抑制作用。最近的研究發(fā)現，CCL23在兒童急性髓系白血病骨髓和外周血樣本均有高表達。為了了解CCL23的高表達在白血病進展、治療和預后中的意義，選用白血病細胞系U937細胞作為研究對象，加入人類重組CC

2、L23培養(yǎng)72小時，用CCK?8試劑盒測細胞增殖， FITC?AnnexinV/PI法檢測細胞凋亡率，并觀察不同處理條件下細胞分化情況及CCL23受體CCR1的表達水平。結果發(fā)現：單獨的CCL23對于U937細胞的增殖、凋亡和分化無明顯作用(P>0.05)；但在U937受PMA誘導分化的過程中， CCL23有明顯的促分化作用，同時發(fā)現此過程中CCR1表達顯著升高(P<0.05)。結論： CCL23對U937細胞無明顯抑制作用，但可能與PMA產生協同誘導分化作用，而且該作用的出現可能與CCL23受體CCR1表達升高有關。    【關鍵詞】 CC

3、L23/MPIF?1；U937細胞；細胞增殖； 細胞凋亡；誘導分化 Effect of CCL23/ Myeloid Progenitor Inhibitory Factor 1 (MPIF?1) on the Proliferation, Apoptosis and Differentiation of U937 Cells    Abstract    CCL23 is a human CC chemokine with potential suppression effects on both human a

4、nd murine myeloid progenitor cells both in vitro and in vivo, and only expressed and released by dendritic cells differentiated from monocytes in blood cells. However, recent study has shown that CCL23 was over?expressed in bone marrow and peripheral blood cells from pediatric patients with acute my

5、eloid leukemia (AML). In order to investigate the effects of CCL23 on the development, therapy and prognosis of leukemia, the U937 cells, a leukemic cell strain, were adopted and cultured with rhCCL23 for 72 hours. The cell proliferation and apoptosis rate were detected by Cell Counting Kit?8 and FI

6、TC?AnnexinV/PI respectively; the morphologic changes and the expression of CCR1 (the only receptor of CCL23 known by now) were observed during the differentiation process. The results showed that no obvious effect on the proliferation, apoptosis and differentiation of U937 was found by using CCL23 a

7、lone (P>0.05), but cultured in combination with CCL23 and PMA, the differentiation of U937 cells were promoted remarkably, during which the CCR1 expression increased (P<0.05). It is concluded that CCL23 alone did not inhibit the proliferation and differentiation of U937, while its use in combi

8、nation with PMA may possess synergistic effect on inducting differentiation of U937 through the increase of receptor CCR1 expression.    Key words    CCL23/ MPIF?1; U937 cell; cell proliferation; cell apoptosis; induction differentiation    

9、;CCL23，又稱骨髓造血祖細胞抑制因子（myeloid progenitor inhibitory factor?1, MPIF?1）、巨噬細胞炎性蛋白3（macrophage inflammatory protein?3, MIP?3）、CK8、 CK8?1，是人類趨化因子CC家族（即類趨化因子）中的一員，于1997年在人主動脈上皮細胞cDNA文庫中分離得到1，其結構與造血抑制因子巨噬細胞炎癥蛋白?1（MIP?1）高度同源2，3,。目前僅發(fā)現其與膜表面受體CCR1有高親和力 4，是其他類趨化因子MIP1和RANTES的競爭配體1,2,5。CCL23在肝、肺、胰和骨髓組織中均有表達，且在單核

10、細胞分化的樹突狀細胞中持續(xù)釋放6，可以作為單核細胞、樹突狀細胞和靜止T細胞的趨化劑7。此外在鼠和人的骨髓干細胞體外克隆培養(yǎng)實驗中發(fā)現，CCL23對定向祖細胞有劑量依賴性的抑制作用1,可以減慢細胞周期8，從而在化療過程中保護正常造血祖細胞抵抗化療藥物對快速增殖細胞的毒性作用9,10。同時其在體內實驗中也有抑制多形核白細胞和單核細胞生成和釋放的作用11。    中國實驗血液學雜志 J Exp Hematol 2007; 15(3)CCL23/骨髓抑制因子1（MPIF?1）對于U937細胞的增殖、凋亡和分化的影響最近一項研究在對急性髓系白血?。ˋML）患兒骨髓

11、和外周血的基因芯片篩查過程中，發(fā)現CCL23有異常的高表達，且其表達水平隨著化療進行而下降，隨復發(fā)而升高12。U937細胞是一種白血病單核系細胞株，易被PMA、GM?CSF等誘導分化，常用來研究體內造血過程13，14。本實驗希望通過研究CCL23對于U937細胞增殖、凋亡和分化的作用,了解CCL23的表達在AML發(fā)病過程中可能的作用和對治療的影響，并為進一步研究其作用機制和臨床應用打下基礎。    材料和方法    實驗材料    U937細胞由同濟醫(yī)學院協和醫(yī)院血液病研究所

12、惠贈，rhCCL23（R&D公司產品）,PMA (Sigma公司產品)，培養(yǎng)液164010胎牛血清(Gibco公司產品），Cell Counting kit?8試劑盒（Technical Manual公司產品）, Annexin V?FITC kit試劑盒（Bender MedSystems公司產品），anti?CCR1(R&D公司產品), 流式細胞儀(FACSCaliburTM， Becton Dickinson公司產品), Elx800酶標儀(Bio?TEK Instruments公司產品)。    方法  

13、60; 細胞培養(yǎng) 將U937細胞培養(yǎng)在配好的培養(yǎng)液中，取對數生長期細胞進行實驗。    細胞增殖檢測 將U937細胞以2×105/ml×100 l接種于96孔板中，加入試劑，在37、5 CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間。然后每孔加入CCK?8 10l，放入培養(yǎng)箱，3小時后用Elx800酶標儀測吸光度。    細胞凋亡測定 將U937細胞以3×105/ml×1ml接種于6孔板中，加入試劑培養(yǎng)，用FITC?AnnexinV/PI法上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

14、0;   細胞分化觀察 觀察培養(yǎng)后細胞形態(tài)由圓形或橢圓形懸浮細胞向梭形或形態(tài)不規(guī)則的貼壁細胞變化的情況。    CCR1的表達水平檢測 采用流式細胞術檢測U937本身以及加入PMA（50 ng/ml）培養(yǎng)24小時后CCR1的表達水平。    統(tǒng)計學分析    用SPSS統(tǒng)計軟件進行t檢驗分析。    結    果    CCL2

15、3對U937細胞生長和凋亡的影響    在試驗組細胞的培養(yǎng)液中加入CCL23（50 ng/ml），培養(yǎng)至24、48、72小時，鏡下觀察試驗組細胞和未加CCL23的對照組細胞。結果發(fā)現在各個時間點，兩組細胞的生長狀態(tài)及數量變化均無明顯差異。用CCK?8法衡量細胞生長情況:加入CCK8孵育3小時后，測450 nm的吸光度，其吸光度值與細胞數量和生長情況成正比。經3次重復實驗，結果如圖1所示。培養(yǎng)24小時，對照組吸光度平均值為2.2±0.097，試驗組為2.314±0.128；培養(yǎng)48小時，對照組2.176±0.135，試驗組2.

16、288±0.143；培養(yǎng)72小時，對照組1.747±0.086，試驗組1.733±0.141。兩組無顯著的統(tǒng)計學差異（P>0.05）。    細胞凋亡率的檢測結果： 對照組凋亡率為3.67%±0.47%，試驗組為3.78%±0.55%，兩組均無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)（圖2為3次實驗中的1次檢測結果）。    CCL23對于U937分化的影響    首先比較了CCL23單用對U937細胞的分化是否有影響,結果

17、發(fā)現加入50 ng/ml的CCL23作用72小時后，試驗組和對照組細胞在形態(tài)上無明顯區(qū)別。隨后，本實驗研究了CCL23對PMA誘導的U937細胞分化的影響。結果表明,在培養(yǎng)72小時后,與單獨使用PMA誘導的U937細胞相比,聯合使用PMA(50 ng/ml)和CCL23處理的U937細胞產生了更多的梭形貼壁細胞,表明CCL23在體外可能協同PMA誘導U937的分化。    為了進一步了解CCL23和PMA的協同作用,我們用PMA(50 ng/ml)處理U937細胞24小時,結果U937細胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化。隨后,用新鮮的RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌細胞

18、終止PMA的作用,然后將細胞等分為兩份,并向其中一份加入50 ng/ml的CCL23，而另一份未加CCL23作為對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后觀察發(fā)現,未添加CCL23的對照組U937細胞仍然維持為圓形懸浮細胞的形態(tài),而添加了CCL23的試驗組中則出現了大量的梭形、多角形、不規(guī)則形狀的貼壁細胞(圖3)。    隨后對U937細胞分化標志物CD14和CD11b表達的檢測結果如圖4所示。對照組細胞的CD14和CD11b的表達水平與其陰性對照相比，平均熒光強度比值(RFI) 小于2，表明其陽性表達很低；而加入了CCL23的試驗組細胞CD14和CD11b的表達水平有

19、明顯升高（RFI>2）。重復實驗3次，測得的CD14表達的RFI值：對照組1.07±0.04，試驗組2.45±0.07；測得的CD11b表達的結果：對照組1.14±0.05，試驗組2.58±0.08。兩組間具有明顯的統(tǒng)計學差異 (P<0.01)，提示試驗組的分化程度明顯高于對照組。    CCR1表達水平檢測    由于CCR1是目前CCL23唯一已知的受體,本研究通過流式細胞儀檢測CCR1水平以了解PMA處理是否能誘導U937細胞中CCR1表達。 在試驗組細胞的

20、培養(yǎng)液中加入PMA(50 ng/ml),而對照組細胞不加PMA,在相同條件下培養(yǎng)24小時后檢測。結果表明，未處理的U937細胞本身CCR1表達不明顯(RFI<2)，而經過PMA誘導24小時后,CCR1的表達即明顯升高(RFI>2)。重復實驗，對照組RFI值為1.22±0.08，試驗組為2.09±0.07（圖5）。兩者之間具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。因此，PMA誘導的CCR1表達可能在CCL23和PMA的協同作用中發(fā)揮了重要作用。    討    論  &

21、#160; 經過大量研究證實，CCL23作為一種骨髓祖細胞抑制因子，無論是在原代造血祖細胞的體外集落培養(yǎng)試驗中，還是在體內試驗中，對于正常祖細胞，尤其是髓系祖細胞的增殖和分化均有明顯的抑制作用15。且其目前唯一已知的受體CCR1在正常骨髓造血細胞，包括各系造血祖細胞、單核細胞和淋巴細胞中均有表達16,17,18。因此不難理解，為什么生長旺盛的正常骨髓細胞不表達CCL236。但最近的研究發(fā)現，CCL23在白血病病人的骨髓細胞中卻有高表達，其在白血病發(fā)病和進展中的作用不明。僅在以往對于白血病病人骨髓細胞表面受體的篩查結果中發(fā)現：白血病細胞低表達或不表達受體CCR119。因此，CCL23對

22、于白血病細胞以及對白血病發(fā)病過程的實際作用情況有待研究。    U937細胞為白血病單核細胞株20，且本身無CCR1表達14，這樣相似的條件為我們研究推測CCL23對于白血病細胞的作用有所啟發(fā)。我們的研究發(fā)現：CCL23在體外對于白血病細胞系U937細胞的增殖、凋亡和分化都并無明顯的直接影響,表明CCL23的高表達對白血病細胞自身并無明顯影響，但CCL23可能通過抑制正常祖細胞的增殖，從而為白血病細胞的增殖提供有利的環(huán)境。這與腫瘤壞死因子（TNF）作用十分類似：白血病細胞高表達TNF，后者對正常造血細胞有明顯的抑制作用，但白血病干細胞本身對該因子的抑制作

23、用并不敏感21。CCL23是否正是通過對周圍細胞產生一種旁分泌作用來調節(jié)自身生長環(huán)境的，其中的具體機制還需實驗證實，進一步的深入研究可能為了解AML的發(fā)病機制和發(fā)展新的化療方案提供新的思路。    本研究中意外的發(fā)現，盡管CCL23單用不能影響U937的分化,但CCL23與PMA在體外具有協同誘導U937細胞分化的作用；而且進一步的試驗表明，單獨的CCL23足以誘導經過PMA預處理的U937細胞發(fā)生分化,這一作用并不需要PMA始終存在。U937細胞本身并不表達CCR1 14，但我們發(fā)現經過PMA誘導后U937細胞的CCR1表達水平顯著上升。由于CCR1是

24、目前CCL23唯一已知的受體,這提示PMA誘導下CCR1的表達可能是CCL23產生作用的基礎。當然,考慮到CCL23通過CCR1對正常骨髓細胞分化的抑制作用4,也不排除PMA處理誘導了其他CCL23未知受體表達的可能性,從而使得CCL23可以誘導經PMA處理的U937細胞發(fā)生分化,其中詳細的信號通路以及分子機制有待深入研究。有意義的是，有研究發(fā)現GM?CSF也有誘導U937細胞表達CCR1的作用14，那么CCL23是否同樣可以與之協同誘導白血病細胞的分化，以及CCR1在其中的作用機制如何？這些研究可能將有助于我們進一步了解CCL23在AML發(fā)生發(fā)展機制和臨床治療中的作用和應用前景。 【參考文獻

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