Westernblot試驗步驟及注意事項

1、Westernblot實驗步驟及注意事項Westernblot實驗步驟1.組織塊稱重2.利用液氮、研缽粉碎組織塊3.加入RIPA緩沖液（每克組織3 ml RIPA）,PMSF（每克組織30卩l(xiāng),10 mg/ml PMSF）,利用Polytron進一步勻漿（15,000轉(zhuǎn)/分*1分鐘）維持4C4.加入PMSF（每克組織30卩l(xiāng),10 mg/ml PMSF）,冰上孵育30分鐘5.移入 離心管4C約20,000 g（約15,000轉(zhuǎn)）15分鐘6.上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20C保存7.進行Bradford比色法測定蛋白質(zhì)濃度8.取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液（體積*蛋白質(zhì)濃度），并加等體積的2X電泳加樣緩沖

2、液9.沸水浴中3分鐘10.上樣11.電泳（濃縮膠20mA，分離膠35mA）12.電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（100mA 40分鐘）13.膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍染色14.Westernblot試劑 盒顯色15.分析比較記錄western blot的實驗步驟及注意事項的資料1.把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。1）轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡。2） 在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕） ，將凝膠夾在中間，保持濕潤和 沒有氣泡。3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向

3、陰極。4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠。5）按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移。6）轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。2.將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。3.用100ml水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液。4.膜置印跡緩沖液中于37C保溫1小時。5.室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。6.用封口機將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。7袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。8混合：NGS（100微升），印跡緩沖液中的 抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動2小時（或4C過夜）9用總體積300ml PBS-Twe

4、en緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml。10.將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升NGS）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動1小時。11. 按步驟9洗滌。12.加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升NGS），于室溫下?lián)u動。 注意事項：western blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)改變，因此那些識別空間表位的抗體不能用于western blot檢測。這種情況可以將表達目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白先 生物素化，再用酶標(biāo)記親和素進行western blot。實驗中取膠和膜需帶手套。Western實驗步驟West

5、ern,也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一Western可以參考如下步驟進行操作。1.收集蛋白樣品（Protein sample preparation）O可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖海绫淘铺焐a(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液，裂解貼壁細(xì)胞、懸浮 細(xì)胞或組織樣品。對于某些特定的亞 細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用 試劑 盒 進行抽提，例如碧云天生產(chǎn)的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提 試劑 盒。O收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，需要測

6、定每個蛋白樣品的蛋白濃度。 根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。 因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容 性差別很大。如果使用碧云天生產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液，可以使用BCA蛋白濃度測定 試劑 盒2.電泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝膠配制O SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻資料進行配制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠 配制試劑 盒。該 試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有 試劑 以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。(2)樣品處理O在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

7、例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋 白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻資料配制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)。O 100C或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。(3)上樣與電泳O冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。O為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量 標(biāo)準(zhǔn)。O電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍進入下層膠時使用高電壓恒壓 電泳。對于Bi

8、o-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置 或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可以設(shè)置在120V左右。SDS-PAGE可以 采用普通的電泳儀就可以滿足要求， 也可以采用碧云天的多功能電泳儀(帶定時)。為了電泳方便起見， 也可以采用整個SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在100V，然后設(shè)定定時時間為90120分鐘。設(shè)置定時可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過頭。O通常電泳時溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) 的電泳情況，預(yù)計目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。3.轉(zhuǎn)膜(Transfer)O我們推薦在Western實驗中選用PVDF膜。硝酸纖維素膜(NC膜)

9、也可以使用，但硝酸纖維素 膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。O通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，轉(zhuǎn)膜時間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過夜。轉(zhuǎn)膜時也可以使用碧云天的多功能電泳儀(帶定時)。具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時間越短。O在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時，通常會有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉(zhuǎn)膜槽放 置在冰浴中進行轉(zhuǎn)膜。O轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量最

10、大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對膜進行染色， 以觀察實際的轉(zhuǎn)膜效果。 也可以用考馬斯亮藍快速染色液對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進行染色，以觀察蛋白的殘留情況。4.圭寸閉(Blocking)O轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。O用微型臺式真空泵吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉60分鐘。對于一些背景較高的抗體，可以在4C封閉過夜。在整個Western過程中我們推薦使用碧云天生產(chǎn)的側(cè)擺搖

11、床，側(cè)向擺動速度比較 緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。5.一抗孵育(Primary antibody incubation)O參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗。O用微型臺式真空泵吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4C在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以在4C緩慢搖動孵育過夜。O回收一抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。6.二抗孵育(Secondary antibody inucubation)O參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。O用微型臺式真空泵吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4C在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。O回收二抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再 加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。7.蛋白檢測(Detection of p